关键词:
隐匿性听力损失
氧化应激
GDF15
耳蜗
毛细胞
带状突触
摘要:
研究背景
隐匿性听力损失(Hidden hearing loss,HHL)是近年来引起人们关注的一种新型听力损失类型。目前研究证据表明,隐匿性听力损失的诱发因素主要包括环境或职业噪声、衰老以及耳毒性药物等。军人由于职业特殊性,易出现因噪声暴露导致的隐匿性听力损失。HHL的主要临床表现是患者主诉聆听困难,尤其在噪音环境中对语言的辨听能力下降。研究初步表明,HHL的发生可能与可恢复的暂时性毛细胞损伤和带状突触受损等有关,但目前对HHL的详细发病机制和病理基础仍然知之甚少,因此有必要进行相关深入研究。既往研究发现,噪声所致听力损失情况下,小鼠听觉系统氧化应激水平明显升高,但氧化应激是否参与隐匿性听力损失的发生发展过程以及如何发挥作用仍不清楚。氧化应激等代谢应激情况下生长分化因子GDF15的表达增加,GDF15的上调对多种疾病导致的组织损伤发挥保护作用,但其对噪声所致听力损失的作用,尤其是与隐匿性听力损失发生发展的关系目前还未被阐明。本研究旨在前期研究的基础上,通过建立隐匿性听力损失C57小鼠动物模型,探究GDF15与氧化应激介导的毛细胞损伤和相关功能障碍在隐匿性听力损失发生中的作用及机制,从而深入理解HHL致病机理和发病机制,为预防和治疗提供理论基础。
研究目的
1.建立军事航空噪声性隐匿性听力损失C57小鼠动物模型,并对其有效性进行评价,为军事航空噪声性HHL的相关研究提供稳定的小鼠动物模型构建方法。
2.通过生物信息学分析和实验验证,观察隐匿性听力损失小鼠耳蜗毛细胞内氧化应激和GDF15水平变化。
3.探究GDF15对隐匿性听力损失小鼠氧化应激及耳蜗毛细胞功能的作用。
研究方法
第一部分:
听力正常的雄性C57BL/6J小鼠随机分成4组,每组30只,分别给予不同强度的军用直升机噪声暴露:105 d B 2 h,110 d B 2 h,110 d B 4 h,115 d B 4 h。将噪声暴露前的小鼠作为对照组,每组根据噪声暴露后不同时间分为5个亚组,分别为对照组、噪声暴露后1 d组(NE-1d)、噪声后7 d组(NE-7d)、噪声后14 d组(NE-14d)和噪声后28 d组(NE-28d),每组6只(12个耳蜗)。各实验组进行相应强度的噪声暴露,并在噪声刺激后不同时间节点进行听性脑干反应测试。筛选出符合造模条件的噪声暴露强度,进行该条件噪声暴露后小鼠内耳基底膜的免疫荧光染色和带状突触计数验证。
第二部分:
听力正常的雄性C57小鼠随机分为对照组(control组)、隐匿性听力损失组(HHL组)和噪声听力损失组(NIHL组)共3组,每组6只。control组作为阴性对照组,NIHL组作为阳性对照组。control组不给予噪声刺激,HHL组给予110 d B 2 h军用直升机噪声刺激,NIHL组给予连续三天的115 d B 4 h军用直升机噪声刺激。取各组小鼠耳蜗进行测序,在单细胞水平进行高通量基因表达谱检测,表征单个细胞的基因表达情况。随后分别在隐匿性听力损失小鼠和细胞模型中对生物信息学分析结果进行验证。
第三部分:
细胞实验中,利用HEI-OC1细胞系,分为control组、GDF15组、H2O2组和H2O2+GDF15组共4组,control组不做处理,其余各组分别进行50μM H2O2或400μM重组GDF15处理。随后对各组进行氧化应激指标检测和细胞凋亡水平检测。动物实验中,听力正常的雄性C57小鼠随机分为分为control组、GDF15组、HHL组和HHL+GDF15共4组,每组6只。control组不做处理,GDF15组给予小鼠耳蜗圆窗注射10μL 10μg/m L的重组GDF15,HHL组接受110 d B 2 h的噪声暴露,HHL+GDF15组给予小鼠耳蜗圆窗注射10μL 10μg/m L的重组GDF15 2 h后接受110 d B 2 h的噪声暴露。分别对各组小鼠进行听觉功能和耳蜗毛细胞氧化应激水平检测。
研究结果
1.105 d B 2 h军用直升机噪声暴露后C57小鼠听阈阈移不显著;110 d B 4 h和115 d B 4 h军用直升机噪声暴露后小鼠听阈发生永久性阈移;110 d B 2 h军用直升机噪声暴露后,C57小鼠听阈暂时性阈移,且ABRⅠ波幅值降低,耳蜗带状突触数量减少,符合HHL的功能学和形态学表现。
2.生物信息学分析结果显示,与阴性对照组小鼠相比,隐匿性听力损失小鼠耳蜗听觉关键细胞毛细胞内氧化应激水平明显升高,其上下调基因在氧化应激相关通路明显富集。同时毛细胞内GDF15水平也明显升高。在隐匿性听力损失小鼠和细胞模型中,耳蜗和毛细胞内氧化应激水平和GDF15水平同样出现明显升高,验证了生物信息学分析中的发现。
3.体外实验中,control组与GDF15处理