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关键词： 猪δ冠状病毒   核衣壳蛋白   蛋白纯化   单克隆抗体  

摘要： 【目的】为制备猪δ冠状病毒(PDCoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的特异性单克隆抗体,通过构建PDCoVN蛋白原核表达载体并实现蛋白可溶性表达,进而通过细胞融合技术筛选特异性杂交瘤细胞株,为PDCoVN蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】采用RT-PCR从PDCoV感染的细胞中扩增N基因,将其克隆至pET-32a载体,构建重组表达质粒pET-32a-PDCoV-N。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Westernblotting验证重组N蛋白的表达情况,并分析其可溶性。以纯化的重组N蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA检测小鼠血清抗体效价,选取高抗体效价小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经HAT、HT培养基筛选及有限稀释法亚克隆,获得稳定分泌抗PDCoVN蛋白抗体的杂交瘤细胞株。通过Westernblotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定单克隆抗体的特异性与反应性,同时检测其与其他常见猪源病毒(PEDV、PRRSV和SADS-CoV)的交叉反应。【结果】成功构建pET-32a-PDCoV-N原核表达载体,重组N蛋白在大肠杆菌中实现可溶性高效表达,分子量约56.4kD。免疫小鼠血清抗体效价在免疫35d后可达1:409600,经细胞融合与筛选获得1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株(命名为3D5)。Westernblotting检测结果表明,3D5单克隆抗体可特异性识别PDCoV感染细胞中的天然N蛋白及原核表达的重组N蛋白;IFA结果显示,该抗体仅与PDCoV感染细胞产生特异性荧光信号,与PEDV、PRRSV、SADS-CoV无交叉反应。【结论】成功制备了PDCoVN蛋白特异性单克隆抗体,为PDCoV 的特异性诊断试剂研发及N蛋白功能研究提供了关键材料。

关键词： 灵芝多糖   营养性肥胖   非靶标代谢组   肠道菌群  

摘要： 目的 基于非靶标代谢组和肠道微生物组学探究灵芝多糖(GLP)对高脂饮食诱导的营养型肥胖大鼠的改善作用及其潜在机制。方法 通过高脂饮食(HFD)构建营养型肥胖大鼠模型,给予不同剂量的GLP连续干预4周,采集样本,考察GLP对营养型肥胖大鼠体重、生化指标及肥胖相关因子的影响,并对血清代谢物和肠道菌群结构进行多元统计分析。结果 GLP干预可显著抑制营养型肥胖大鼠体重增长,降低脂肪指数。GLP还可显著降低空腹血糖(Glu)、瘦素(LEP)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、胰岛素(INS)和脂多糖(LPS)水平。非靶标代谢组学共鉴定出26种差异代谢物,其中糖基脱氧胆酸、石胆酸、N-二十二碳六烯酰GABA和脱氧胆碱甘氨酸等15个代谢物被上调,12S-羟基-5Z,8E,10E-七二烯酸、溶磷脂酰胆碱[20∶3(8Z,11Z,14Z)/0∶0]、溶磷脂酰胆碱[22∶5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]和N-花生四烯酰甘氨酸等11个代谢物被下调,涉及氨基酸、甘油磷脂、胆汁酸以及亚麻酸等。主要影响的代谢通路为组氨酸代谢、甘油磷脂代谢和初级胆汁酸生物合成。肠道菌群分析表明,高剂量GLP显著降低了厚壁菌门/拟杆菌门比值,下调奎因氏菌属和UCG_005菌属相对丰度(P<0.05)。结论 灵芝多糖能够有效改善高脂饮食诱导的营养型肥胖及相关代谢紊乱,其机制可能与调节肠道菌群结构、干预组氨酸代谢、甘油磷脂代谢及胆汁酸代谢等关键通路有关。本研究从“肠道菌群-宿主代谢”轴阐释了GLP的抗肥胖作用,为其进一步开发提供科学依据。

关键词： 桂郁金   多糖   金属配合物   结构表征   益生元  

摘要： 为研究桂郁金多糖及其锌多糖的益生元作用,将水提桂郁金多糖(Water extracted polysaccharide from Curcuma kwangsiensis,WPCK)与锌配合,制得桂郁金多糖锌(WPCK-Zn)。通过锌含量、总糖含量、蛋白质含量以及溶解度研究其理化性质;采用紫外-可见光谱、傅里叶红外光谱、扫描电镜(SEM)、Zeta电位等对其进行结构表征。通过模拟唾液、胃液和肠液检验WPCK和WPCK-Zn的抗消化性,最后研究了WPCK和WPCK-Zn对短乳杆菌GIM1.773(Lactobacillus brevis)、植物乳杆菌GIM1.191(Lactobacillus plantarum)、德氏乳杆菌保加利亚亚种GIM 1.155 [Lactobacillus delbrueckii (sub sp.) bulgaricus] 和嗜热链球菌GIM1.540(Streptococcus thermophilus)四种益生菌的促进增殖作用。结果表明,WPCK-Zn的总糖含量和蛋白质含量分别为70.53%和0.19%,与WPCK相比均有所降低。WPCK-Zn的锌含量为29.39 mg/g,且仍具有多糖基本结构、官能团分布以及三螺旋结构,扫描电镜表明WPCK-Zn与WPCK相比外表更均匀光滑,热稳定性和Zeta电位绝对值均有所增加,且WPCK和WPCK-Zn都以非定型的结晶态存在。体外模拟消化实验表明,WPCK与WPCK-Zn都具有抗消化特性,可以有效抵抗消化系统的消化作用,从而确保进入肠道后被肠道菌群利用。益生元作用研究表明,两者对于四种益生菌都具有益生元作用,且WPCK-Zn的益生元作用比WPCK更好,WPCK-Zn浓度为2%时,均对短乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌有较好的促进增殖作用。桂郁金多糖锌具有作为一种新型补锌剂的潜力,为桂郁金多糖及其金属配合物在功能性食品或微生态制剂中的应用提供理论依据。

关键词： 大鳞高须鱼   肌肉   营养成分   氨基酸   脂肪酸  

摘要： 试验旨在系统评价大鳞高须鱼不同生长阶段的肌肉营养品质。分别测定幼鱼组、中鱼组和成鱼组肌肉样本的常规营养成分、氨基酸、脂肪酸及矿物质元素含量。结果显示,各组肌肉中粗蛋白含量为17.56%~19.30%,粗脂肪含量为1.32%~4.50%,粗灰分含量为1.22%~1.32%;总氨基酸(TAA)含量为14.74%~16.93%,其中必需氨基酸(EAA)/TAA为37.59%~38.55%,鲜味氨基酸(DAA)/TAA为38.53%~39.34%。不饱和脂肪酸(UFA)含量为66.91%~67.95%,二十碳五烯酸(EPA)+二十二碳六烯酸(DHA)含量为2.27%~10.25%;矿物质元素含量丰富且比例均衡。研究表明,大鳞高须鱼肌肉蛋白质含量高、氨基酸组成均衡、脂肪酸营养价值突出,属于优质蛋白源。

关键词： 猪IRAV   干扰素刺激基因   原核表达   小鼠免疫   单克隆抗体   免疫学工具  

摘要： IRAV作为干扰素刺激基因具有显著的抗病毒活性,但缺乏猪源IRAV商业化特异性抗体导致IRAV在猪相关疫病中的调控作用研究严重受限。为解决这一问题,本研究拟通过大肠杆菌表达系统表达重组IRAV蛋白并制备其单克隆抗体。通过PCR方法扩增猪源IRAV基因,构建重组原核表达质粒pET-28a(+)-IRAV,经IPTG诱导重组IRAV蛋白表达并纯化后,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,采用间接ELISA方法测定腹水抗体效价;通过IFA和Western blot验证抗体特异性;利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型。结果表明,成功表达了猪源重组IRAV蛋白,获得5株特异性单克隆细胞株,命名为:8H10D2H6、5F2D12D6、6A9C3B2、6F9C4B7、1C8A3G5。测定腹水效价均在1:500 000~1:2 500 000之间。5株单克隆抗体经IFA和Western blot验证,确定其能够与原核及真核表达系统所表达的IRAV蛋白发生特异性结合反应。经亚型鉴定,8H10D2H6株单克隆抗体属于IgG2a重链类,而5F2D12D6、6A9C3B2、6F9C4B7和1C8A3G5四株单克隆抗体属于IgG2b重链类,轻链均为Kappa型。以该单克隆抗体为工具,通过Western blot和IFA试验初步证明了猪源IRAV能够抑制PRRSV的增殖。综上,本研究成功制备了猪源IRAV单克隆抗体,其在研究IRAV抗PRRSV中可以作为良好的免疫学工具,这为后续研究IRAV蛋白在猪重要疫病中的调控作用提供了科学依据。

关键词： 兰科菌根   共生萌发   植物-真菌互作   活性成分积累   药用品质  

摘要： 石斛属Dendrobium植物是兰科重要的药用与观赏类群,其生长发育与共生真菌密切相关。为发掘具有应用潜力的石斛共生真菌资源,本研究采用组织块分离法从霍山石斛Dendrobium huoshanense根中分离获得一株胶膜菌属Tulasnella真菌C0337。通过实验室共生培养试验,系统评估了该菌株对铁皮石斛D. officinale和霍山石斛D. huoshanense种子萌发的影响,并进一步评价了其与铁皮石斛幼苗共培养过程中对植株生长、茎多糖积累的作用。结果表明,该胶膜菌在OMA培养基纯培养和基质条件下均能显著促进两种石斛种子萌发;可明显促进铁皮石斛植株生根和幼苗分蘖,并显著提高其茎中多糖含量。本研究为药用石斛共生真菌资源的开发及其在石斛栽培和品质调控中的应用提供菌种资源和依据。

关键词： 育肥牛   过瘤胃氨基酸   消化率   氮代谢   瘤胃发酵  

摘要： 试验旨在探究低蛋白饲粮中补充不同水平过瘤胃赖氨酸(RPLys)和蛋氨酸(RPMet)对育肥牛生长性能、消化代谢及瘤胃发酵的影响。选取48头6~7月龄体况良好、体重(200.00±10.00) kg的西杂牛公犊,随机分为4组,每组4个重复,每个重复3头牛。对照组饲喂基础饲粮[粗蛋白(CP)水平15.13%];试验1组饲喂低蛋白饲粮(CP水平为13.13%),补充10 g/d RPLys+5 g/d RPMet;试验2组饲喂低蛋白饲粮,补充20 g/d RPLys+10 g/d RPMet;试验3组饲喂低蛋白饲粮,补充30 g/d RPLys+15 g/d RPMet。预试期7 d,正式试验期120 d。结果显示:试验2组第120天体重和平均日增重显著高于对照组(P<0.05),料重比显著低于对照组(P<0.05);试验组平均日干物质采食量显著低于对照组(P<0.05)。试验2组血清尿素氮(BUN)含量显著低于对照组(P<0.05),CP、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)表观消化率显著高于对照组(P<0.05)。对照组的摄入氮和粪氮均显著高于试验组(P<0.05),尿氮、粪氮/摄入氮、尿氮/摄入氮显著高于试验2组(P<0.05);试验2组保留氮、氮利用率、氮表观消化率显著高于对照组(P<0.05)。试验2组丙酸含量显著高于其他组(P<0.05),乙丙比显著低于对照组(P<0.05)。研究表明,低蛋白饲粮中添加20 g/d RPLys+10 g/d RPMet可以改善育肥牛生长性能,提高氮利用率及氮表观消化率,有效改善瘤胃发酵环境。

关键词： 螺旋霉素   活性分子探针   基于活性的蛋白质组分析   靶点   淀粉样前体蛋白  

摘要： 可利霉素是一种在医药领域广泛使用的大环内酯类抗生素,主要成分为3种不同的螺旋霉素衍生物。然而随着相关研究的深入,近期发现可利霉素以及多种不同结构的螺旋霉素衍生物都具有一定的抗癌活性,说明利用螺旋霉素作为母核,进行不同的取代基修饰,可能能够得到更好的抗癌活性药物。虽然螺旋霉素有着成为抗癌药物的潜力,但是其靶点及完整机制的研究依然欠缺。为了揭示其抗癌作用机制,本研究采用了基于活性的蛋白质组分析(ABPP)策略,设计并合成了一种高活性螺旋霉素衍生物正己酰螺旋霉素(h-SPM),进而依据其结构合成了一种结构相似且带有适用于ABPP实验官能团的活性分子探针。利用该探针与细胞蛋白质共孵育,使两者结合,从而捕获h-SPM潜在的药物靶点,随后对探针结合的蛋白质进行分离纯化与质谱分析,获得详细的靶点蛋白质信息。进一步通过基因本体(GO)分析挖掘这些蛋白质性质和功能,得到明确的功能信息,并据此筛选出若干潜在靶点蛋白质。通过上述方法,从蛋白质谱的结果中鉴定出包括淀粉样前体蛋白(APP)、低密度脂蛋白受体(LDLR)在内的多个h-SPM潜在作用靶点,并采用免疫印迹(Western Blotting)方法确定这些蛋白质对h-SPM产生了响应。随后,通过短发夹RNA(shRNA)介导的蛋白质敲低及细胞染色等实验,证明蛋白质APP在该药物发挥作用的过程中扮演关键角色,初步揭示了该类药物的抗癌作用机制。本研究不仅建立了适用于螺旋霉素类化合物的靶点筛选方法,也为该类药物的后续开发提供了关键靶点线索与理论依据。

关键词： 哺乳动物   精子   蛋白质翻译  

摘要： 哺乳动物精子细胞核中组蛋白被鱼精蛋白替换,染色质高度浓缩且细胞器大量丢失,因此传统观点认为成熟精子核基因的转录和翻译均处于静默状态。然而,随着组学、无终止开放阅读框环状RNA及表面翻译感知等技术的发展,越来越多的研究证实,成熟精子仍具备功能性蛋白质的翻译能力。本文系统综述了哺乳动物精子核基因编码蛋白质翻译的研究进展,聚焦其在获能及液态保存条件下的动态调控,重点阐述翻译的空间定位、调控机制与合成蛋白的生理功能,以期为精子功能调控研究及生殖技术优化提供理论参考。

关键词： 孤囊马尾藻   岩藻多糖   提取工艺优化   乙酰胆碱酯酶抑制活性   抗氧化活性  

摘要： 岩藻多糖是一类富含岩藻糖的硫酸化活性多糖,目前主要从褐藻中提取,在食品和生物医药等领域具有重要的应用价值。海南省拥有丰富的孤囊马尾藻(Sargassum oligocystum)资源。为促进该资源的高值化利用,本研究采用超声辅助水提法,通过正交试验优化了孤囊马尾藻岩藻多糖的提取工艺,并分析了其对乙酰胆碱酯酶的抑制活性及其抗氧化活性。结果表明:在料液比为1︰50(g·mL-1)、75℃条件下浸提4 h,岩藻多糖得率为(4.94±0.06)%,比优化前提升了398.99%。浸提温度、料液比和浸提时间对岩藻多糖得率影响最显著。岩藻多糖对乙酰胆碱酯酶有抑制活性且表现为浓度依赖型,在质量浓度为300μg·mL-1时抑制率达12.10%;此外,岩藻多糖对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基均具有清除作用,在5 mg·mL-1下清除率分别为11.25%、41.93%和44.88%。研究表明,孤囊马尾藻岩藻多糖有较显著的乙酰胆碱酯酶抑制活性和抗氧化活性,展现出开发为抗阿尔茨海默病相关功能性食品或药物的潜力。