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关键词： 少弱精子症   肾阳虚   龟鹿二仙口服液   药效学   蛋白质组学   下丘脑-垂体-靶腺轴   Toll样受体4/核因子κB抑制因子/核转录因子-κB  

摘要： 目的：探究龟鹿二仙口服液（GLEX）治疗肾阳虚型少弱精子症（OAS）的作用机制。方法：将56只SD大鼠随机分为对照（C）、模型（M）、GLEX低（GLEX-L）、中（GLEX-M）、高剂量（GLEX-H）、五子衍宗丸（WZYZP）、左卡尼汀（LOS）组，每组8只。采用腺嘌呤200 mg·kg–1·d–1灌胃30 d的方法制备肾阳虚型OAS模型，给药组分别予GLEX-L、GLEX-M、GLEX-H(2.7、5.4、10.8 mL·kg–1·d–1)、WZYZP(1.269 g·kg–1·d–1)、LOS(2.0 mL·kg–1·d–1)治疗。观察各组大鼠一般情况，计算睾丸及附睾脏器指数，用精子分析仪检测精液质量，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）测定血清下丘脑-垂体-靶腺轴激素水平，苏木素-伊红（HE）染色观察睾丸组织形态并计算Johnsen得分，JC-1流式细胞术检测线粒体膜电位（MMP）。采用数据非依赖采集（DIA）定量蛋白质组学技术筛选GLEX治疗肾阳虚型OAS的关键通路，蛋白质免疫印迹法（WB）验证大鼠睾丸组织中关键蛋白质Toll样受体4（TLR4）、核因子κB抑制因子（IκB）、核转录因子-κB p65（NF-κB p65）表达。结果：与C组相比，M组大鼠萎靡迟缓、脱毛蜷缩、便溏背凉，体质量增长缓慢，睾丸指数显著升高（P<0.01），精子活率、快速前向运动显著降低，畸形率显著升高（P<0.05，P<0.01），血清促甲状腺激素（TSH）、促卵泡激素（FSH）、促黄体生成素（LH）及雌二醇(E2)显著增加（P<0.01），而促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、皮质醇（Cor）及睾酮（T）水平的改变差异无统计学意义，生精小管萎缩、生精细胞脱落、精子减少，Johnsen评分显著降低（P<0.01），MMP聚合物/单体值显著降低（P<0.01）；治疗后上述指标得到不同程度改善。蛋白组学结果表明，GLEX主要通过Toll样受体通路、自噬-动物、NOD样受体通路等发挥补助肾阳、治疗OAS的作用。选择TLR4/IκB/NF-κB通路进行验证，结果表明，与C组相比，M组大鼠睾丸组织TLR4表达增多、IκB-α和NF-κB p65磷酸化增加（P<0.05，P<0.01），GLEX干预后上述蛋白质表达显著减少（P<0.05）。结论：GLEX可改善肾阳虚型OAS大鼠的精子质量、睾丸组织损伤、线粒体功能及激素水平，其机制可能与TLR4/IκB/NF-κB通路相关。

关键词： 乳酸代谢   组蛋白乳酸化   骨髓间充质干细胞   细胞衰老   成骨分化   骨质疏松   代谢干预   茜素红   SA-β-gal   组织再生  

摘要： 目的 探究乳酸生成及组蛋白乳酸化在小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）衰老过程中的表达变化，以及乳酸代谢对衰老BMSCs成骨分化的影响，为衰老相关骨质疏松及骨修复障碍的代谢调控干预提供理论依据和实验基础。方法 采用全骨髓贴壁法提取小鼠BMSCs，经流式细胞术鉴定表面标志物（CD29、CD90）。建立不同浓度依托泊苷（0、5、10、15、20μmol/L）诱导BMSCs衰老的细胞模型，通过qRT-PCR和Westernblot检测衰老相关指标（p53、p21、p16）基因和蛋白的表达水平，结合CCK-8和SA-β-gal实验确定最适诱导浓度。将BMSCs分为对照组和依托泊苷诱导衰老组，检测乳酸生成水平和组蛋白乳酸化相关酶（Ldha、Ep300、Sirt2）的表达；采用Westernblot检测泛乳酸化及组蛋白乳酸化修饰H3K18la的变化。将BMSCs分为对照组、依托泊苷诱导衰老组、依托泊苷+乳酸脱氢酶抑制剂GNE-140组，通过qRT-PCR、Westernblot及SA-β-gal染色评估抑制乳酸生成对细胞衰老表型的影响。成骨分化实验中，设置对照组、依托泊苷诱导衰老组、外源性乳酸钠干预组（5mmol/L和10mmol/L），采用qRT-PCR和Westernblot检测成骨分化标志物（Col1、Runx2、Sp7、Alpl、Ocn）变化；茜素红染色观察BMSCs形成矿化结节的情况。结果 流式细胞术显示，BMSCs高度表达CD29（97.3%）和CD90（95.7%）。依托泊苷以10μmol/L为最适浓度，通过激活p53–p21通路诱导衰老。与对照组相比，衰老BMSCs中乳酸生成减少，Ldha、Ep300mRNA表达下降（P<0.001），Sirt2mRNA上调（P<0.01），泛乳酸化和H3K18la修饰水平下调（P＜0.001）。使用GNE-140抑制乳酸生成后，p53、p21表达及SA-β-gal阳性细胞比例进一步升高（P<0.01）。成骨分化实验中，衰老BMSCs的Runx2、Sp7、Alpl、Col1、Ocn表达水平及矿化结节形成能力均下降（P<0.05）；外源性补充5mmol/L和10mmol/L乳酸钠可改善衰老BMSCs的成骨分化能力和矿化结节形成的情况。结论BMSCs衰老伴随着乳酸生成减少和组蛋白乳酸化修饰水平降低；外源性补充乳酸钠可改善衰老BMSCs的成骨分化障碍。

关键词： 绵羊肺炎支原体   RAA   核酸检测   等温扩增   CRISPR/Cas12a  

摘要： (目的)通过将重组酶介导等温核酸扩增（recombinase-aided amplification， RAA）和成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR）以及酶标仪或试纸条相结合，建立一种快速、高特异性和高灵敏度的绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）核酸检测方法。（方法）本研究以MO参考株Y98 16S rRNA基因为靶标，设计特异性的CRISPR RNA（crRNA）和RAA引物，利用RAA技术扩增靶标核酸，并进行CRISPR/Cas12a荧光和试纸条检测，然后评价该方法的特异性、灵敏度及与PCR法的一致性。（结果）结果表明该方法最低可检测到3.04 copies·μL-1，且与羊呼吸道常见菌如山羊支原体山羊肺炎亚种、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、不动杆菌等均无交叉反应。进一步对45份临床样品进行检测，结果表明本研究建立的核酸检测方法与PCR检测方法阳性符合率为97.2%，Kappa值为0.93。（结论）综上，本研究建立的MO RAA-CRISPR/Cas12a核酸检测方法具有特异性高、灵敏度好、对昂贵仪器依赖度低、可用于现场快速可视化检测等优势。该方法最终结果可以通过酶标仪或试纸条来判读，既可用于实验室高通量检测，也可用于养殖场现场可视化检测，为MO的临床快速诊断提供了新的技术手段。

关键词： 毛蜂窝菌   多糖   结构表征   免疫活性   抗氧化  

摘要： 该研究以毛蜂窝菌（Hexagonia apiaria）为原料，采用热水浸提法制备其多糖（Hexagonia apiaria refined polysaccharides，HARP），并通过DEAE-Sepharose FF离子交换柱和Smartdex G-100凝胶柱分离纯化，得到2个多糖组分HARP4-Ⅰ和HARP4-Ⅱ。进一步运用高效凝胶渗透色谱、红外光谱、紫外光谱、刚果红实验、扫描电镜及PMP柱前衍生化高效液相色谱等技术对其进行结构表征；利用RAW264.7细胞研究HARP4-Ⅰ和HARP4-Ⅱ的免疫活性，通过CCK-8法和Griess法测定HARP4-Ⅰ和HARP4-Ⅱ对RAW264.7细胞的细胞活力、NO含量的影响；对HARP4-Ⅰ和HARP4-Ⅱ的体外抗氧化活性进行评价。结果表明，HARP4-Ⅰ与HARP4-Ⅱ均是以葡萄糖为主，由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、木糖组成的杂多糖，不含糖醛酸及三股螺旋结构，分子质量分别为4.0 kDa和3.4 kDa。此外，HARP4-Ⅰ与HARP4-Ⅱ均具有明确的免疫调节活性，并对DPPH、ABTS阳离子自由基具有浓度依赖性的清除能力，同时表现出总抗氧化能力。该研究首次从毛蜂窝菌多糖中分离纯化出2个结构明确、具有显著体外免疫调节和体外抗氧化活性的多糖组分，为其作为天然免疫调节剂或抗氧化剂的进一步开发奠定了理论基础。

关键词： 肝癌细胞   增殖   迁移   凋亡   甘青青兰多糖  

摘要： 目的：探讨甘青青兰多糖（dracocephalum tanguticum polysaccharide,DrTP）对不同肝癌细胞迁移、凋亡及周期的影响。方法 ：取鼠源Hepa1-6、H22，人源HepG2、Huh-7细胞，采用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8），根据半抑制浓度值(half maximal inhibitory concentration,IC50)筛选敏感细胞株；通过细胞形态学观察及平板克隆实验检测DrTP对肝癌细胞Hepa1-6、HepG2增殖的影响；通过细胞划痕实验与Transwell迁移实验检测其对细胞迁移能力的影响；通过细胞周期实验检测DrTP对Hepa1-6、HepG2细胞周期的影响；通过Hoechst染色及细胞凋亡实验检测DrTP对细胞凋亡的影响。结果：筛选出敏感细胞株鼠源为Hepa1-6、人源为HepG2细胞；DrTP可抑制Hepa1-6和HepG2细胞增殖，降低两种肝癌细胞的迁移能力（P<0.05），阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡（P<0.01）。结论：DrTP具有抑制Hepa1-6、HepG2细胞迁移、诱导细胞凋亡及阻滞细胞周期的作用。

关键词： 猴头菇多糖   结肠炎   肠道菌群   粪菌移植  

摘要： 结肠炎严重影响患者生活质量，肠道菌群失调和炎症反应是其关键病理机制。该研究旨在探究猴头菇多糖通过调节肠道菌群对结肠炎小鼠的保护作用及机制。将C57BL/6小鼠随机分为模型组与低、中、高剂量猴头菇多糖组（100、200、400 mg/kg），灌胃预保护14 d后，饮用2.5% DSS溶液7 d建立结肠炎模型，随后恢复5 d。通过疾病活动指数（disease activity index，DAI）和HE染色评估保护效果；采用16S rDNA测序分析肠道菌群变化；通过抗生素干预和粪菌移植实验验证其作用机制是否依赖于肠道菌群。结果表明猴头菇多糖干预显著改善结肠炎小鼠体重和DAI评分，延长结肠长度，降低肠道组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平，其中200 mg/kg剂量效果最佳。16S rDNA测序显示，猴头菇多糖显著提高Eubacterium＿coprostanoligenes＿group， Muribaculum， Clostridia＿UCG-014等益生菌丰度。抗生素干预和粪菌移植实验证明猴头菇多糖可通过肠道菌群发挥结肠炎保护作用。该研究为猴头菇作为天然功能食品在肠道健康领域的应用提供了科学依据。

关键词： 发酵粘液乳杆菌   奶酪源   比较基因组学   遗传多样性   潜在益生基因  

摘要： 发酵粘液乳杆菌作为一种潜在的益生菌资源，其基因组功能研究对菌株的开发应用具有重要意义。该研究对40株分离自埃及奶酪的发酵粘液乳杆菌开展比较基因组学分析，系统解析了其基因组特征。结果显示，其具有开放的泛基因组特征；平均核苷酸一致性聚类与系统发育树结果一致，将菌株划分为Clade A和Clade B两个独立分支。Clade A在基因组大小与编码序列数量上显著高于Clade B（P<0.05），且2个分支在代谢基因分布上也存在显著差异（P<0.05）。具体表现为Clade A特有GH47、GH27和GT113等家族酶，Clade B特有GH70与GT111等家族酶，同时2个分支还分别富集了专属的代谢通路。此外，所有菌株仅检测到1种耐药基因，未发现毒力因子，具有良好的安全基础。功能基因注释结果显示，分离株包含胞外多糖、叶酸、色氨酸及核黄素合成基因，氧胁迫、酸胁迫、胆盐胁迫耐受及宿主粘附相关基因。研究结果为该菌种后续功能验证、机制研究及工业菌株选育提供了重要理论依据。

关键词： 大豆油脂体   虾青素   可食用膜   圣女果   保鲜  

摘要： 为探讨大豆油脂体在可食用膜中的作用，该研究以虾青素-大豆油脂体乳液添加量为变量，制备含虾青素-大豆油脂体乳液的可食用膜（astaxanthin-soybean oil body emulsion edible film， AST-SOB），对其理化性能、微观结构进行了评估，并探究AST-SOB膜在圣女果贮藏保鲜中的应用效果。结果表明，添加虾青素-大豆油脂体乳液后，可食用膜结构更加均匀致密，红外光谱分析发现，成膜过程中没有产生新的官能团，说明虾青素-大豆油脂体乳液与膜基质具有较好的互容性，且可食用膜的机械性能、抗氧化性能、抑菌性能、降解性能均有所增强。其中，AST-SOB75%膜综合性能最优，膜的抗拉强度和断裂伸长率分别增加到(3.15±0.07) MPa（P<0.05）和(65.37±2.28)%（P<0.05），对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基清除率分别提高到48.54%和31.78%（P<0.05），对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌性能分别提高了1.74和1.85倍（P<0.05）。AST-SOB75%膜在土壤中降解30 d后，膜表面裂开，变得柔软。扫描电子显微镜测定结果表明，AST-SOB75%膜表面更加光滑、内部结构均匀致密，对水蒸气有较高的阻隔性能（P<0.05）。此外，AST-SOB75%膜包裹圣女果能够抑制果实呼吸代谢，延缓水分和营养物质流失，有效延长圣女果在4 ℃下的保质期。综上，该研究为开发新型油脂体基可食用膜用于食品保鲜提供思路和理论依据。

关键词： 松针多糖   乳酸钾   羧甲基修饰   保湿性能   水分分布  

摘要： 为开发具有良好保湿性能的保湿剂，以红松松针为原料制备松针多糖，对其进行羧甲基化改性，研究其结构特性及保湿行为。通过比较羧甲基改性前后多糖的理化性质，分析改性对分子结构及吸湿性能的影响，对其吸湿过程进行动力学模型拟合。将羧甲基松针多糖与乳酸钾按不同比例复配，通过平衡水分含量评价复配体系的保湿性能，结合接触角测试和低场核磁共振技术，分析其润湿特性及水分分布状态。结果表明，在提取时间2 h、提取温度80 ℃、液料比80∶1 （mL/g）和超声功率250 W条件下，松针多糖得率为5.48%。羧甲基改性后，多糖分子量降低而单糖组成基本保持不变，其在滤纸模型中的平衡水分含量最高可达6.03%。当羧甲基松针多糖与乳酸钾质量比为1∶3时，复配体系的平衡含水率进一步提高至6.25%。接触角和低场核磁分析结果显示，复配保湿剂具有良好的润湿性能，可显著增加体系中结合水比例。羧甲基松针多糖–乳酸钾复配体系表现出优良的保湿性能，具有作为复合保湿剂的应用潜力。

关键词： 体细胞核移植技术   胎盘异常   内源性逆转录病毒   合胞素   合胞素异常相关疾病  

摘要： 胎盘发育异常是克隆动物低出生率及高发育缺陷率的重要病理基础。合胞素基因家族是胎盘特异表达的关键逆转录病毒源融合蛋白，参与胎盘形成与功能行使。合胞素表达异常不仅会直接破坏胎盘的正常结构与功能，导致体细胞克隆动物胎盘异常，还与多种疾病相联系。本文详细介绍了克隆动物胎盘中存在的典型病理表型及合胞素对胎盘发育的影响，并提出未来需针对合胞素通路分子靶点进行干预，以改善克隆效率的研究方向，为深入理解并解决克隆动物的发育难题提供参考。