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关键词： IBV   反向遗传   BAC系统   感染性克隆  

摘要： 为构建IBV反向遗传感染性克隆平台,本研究在细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)反向遗传系统的基础上,对pCC1BAC载体进行改造,并利用无缝克隆技术,将pCC1BAC质粒作为骨架载体,在禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisvirus,IBV)基因组的5'端引入T7启动子序列以及3'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HDVRz)和多聚腺苷酸化尾巴序列,构建了IBVH120弱毒株的全长cDNA感染性克隆pBAC-H120。为区分亲本株与克隆株,将亲本株第16785、15786与15788位点核苷酸进行G到A、C到T及A到C的无义突变,即将GAG(Glu)CTA位点变为EcoR I GAA(Glu)TTC酶切位点作为遗传标记。将pBAC-H120感染性克隆与辅助质粒共转染BHK-21细胞,反复冻融离心后收获细胞液,将其接种至9日龄SPF鸡胚中,传代至5代后,收取尿囊液为重组病毒rH120提取病毒核酸并观察胚体,对收获的病毒进行鉴定。结果显示:基因序列分析rH120含有重组毒株遗传标记的无义突变,改造后的BAC反向遗传系统构建的感染性克隆pBAC-H120拯救成功,鸡胚实验显示重组毒株与亲本株具有相同生物特性的感染性病毒。本研究成功构建了基于改造BAC载体的IBV反向遗传操作系统,该平台为IBV致病相关基因的功能解析及病毒-宿主互作的分子机制研究提供了遗传学工具,为重组活载体疫苗设计及新型疫苗候选株的构建奠定了基础。

关键词： 动态牵张   三维培养   人骨髓间充质干细胞   成骨分化  

摘要： 目的:探究动态牵张对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSCs)三维培养中成骨分化的促进作用。方法:对载有hBMMSCs的三维培养体系进行动态牵张,设置动态牵张的比例(5%、10%、20%)、频率(0.5Hz)和时间(2 h/d),以静态培养为对照组;通过胞质荧光染色观察动态牵张引起的hBMMSCs形变;动态牵张培养7 d后,通过细胞活死染色观察动态牵张对hBMMSCs活性的影响,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及定量实验,成骨相关基因和蛋白的表达观察动态牵张对hBMMSCs成骨分化的影响。结果:成功构建动态牵张三维培养hBMMSCs,可实现不同持续时间、频率和动态牵张的比例;动态牵张使得hBMMSCs发生形变,牵张比例越大,细胞形变越明显,从圆形向扁椭圆形变化;动态牵张培养7天后,静态对照组和动态牵张各实验组中hBMMSCs基本为绿染的活细胞,仅有个别红染的死细胞,活细胞比例各组之间的差异无统计学意义(P>0.05);动态牵张各组较静态对照组ALP大体染色深,镜下ALP染色阳性细胞数量多,成骨相关基因和蛋白的表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05),其中动态牵张10%组ALP大体染色最深,阳性细胞数量最多,成骨相关基因和蛋白的表达较静态对照组增加最为显著。结论:动态牵张使得hBMMSCs发生形变,对细胞活性无明显影响,能够有效促进hBMMSCs成骨向分化。

关键词： 姜黄素   育肥猪   抗氧化能力   Keap1/Nrf2通路   脂多糖  

摘要： 【目的】旨在研究饲粮中添加姜黄素对脂多糖(LPS)诱导的育肥猪抗氧化功能和相关通路基因表达的影响。【方法】选取健康、体重相近(60 kg±0.45 kg)的杜×长×大三元育肥猪48头,随机分为4个处理组,每个处理组12个重复,每个重复1头育肥猪。对照组(CON)和脂多糖组(LPS)饲喂基础饲粮,姜黄素组(CUR组)和姜黄素+脂多糖组(CUR+LPS)在基础饲粮中额外添加500 mg/kg的姜黄素。LPS和CUR+LPS组在试验屠宰前12 h对育肥猪腹腔注射LPS,剂量为100 μg/kg BW,CON组同期注射等体积生理盐水,试验期为28 d。试验结束后,采集育肥猪的血清、肝脏及空肠组织样本,测定其相关抗氧化指标与基因mRNA相对表达水平。【结果】①与CON组相比,CUR组育肥猪终末体重和平均日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05)。②与CON组相比,LPS组育肥猪血清、肝脏及空肠中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P<0.05),丙二醛含量显著升高(P<0.05)。与CON组相比,CUR组育肥猪血清、肝脏及空肠总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性显著升高(P<0.05),丙二醛含量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,CUR+LPS组育肥猪血清、肝脏及空肠中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高(P<0.05)。③在空肠Keap1-Nrf2通路基因表达方面,与CON组相比,LPS组育肥猪空肠Keap1 mRNA 表达显著上调(P<0.05),Nrf2、HO-1、SOD1、CAT mRNA 表达显著下调(P<0.05);CUR组则呈现相反显著变化趋势(P<0.05)。与LPS组相比,CUR+LPS组育肥猪空肠Keap1 mRNA表达显著下调(P<0.05),Nrf2、HO-1、SOD1、CAT mRNA表达显著上调(P<0.05)。【结论】姜黄素可通过调控Keap1/Nrf2信号通路的基因表达,缓解LPS诱导的育肥猪急性氧化应激损伤,为其在畜牧生产中作为天然抗氧化饲料添加剂,针对性防控育肥猪急性氧化应激、保障养殖健康提供理论依据与实践参考。

关键词： 单体氢同位素   微生物生物标志物   自养微生物   异养微生物   NADPH  

摘要： 微生物脂类生物标志物单体氢同位素(δD,‰)作为新兴的生物地球化学示踪工具,近年来在解析微生物代谢过程及重建古环境等领域凸显重要应用潜力。生物标志物的氢同位素分馏主要发生于微生物代谢过程,其分馏机制可归纳为微生物代谢类型的内在差异与环境变量的外在调控两大方面。文章系统梳理了不同营养类型微生物(光合自养型、化能自养型和异养型)脂类生物标志物氢同位素分馏机制的研究进展,重点对比了3种类型微生物氢同位素分馏特征及差异,并深入探讨由微生物代谢过程与环境因素综合影响所导致的分馏差异机理,根本原因在于生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的代谢途径不同。本综述旨在构建不同营养类型微生物生物标志物单体氢同位素分馏的理论框架,为利用其代用指标重建过去环境与生物地球化学循环变化提供科学支撑。

关键词： 芪芎左归复方   神经功能   脑卒中   大脑中动脉闭塞-再灌注   外泌体   大鼠  

摘要： 目的 研究芪芎左归复方调控骨髓间充质干细胞源性外泌体对衰老大脑中动脉闭塞-再灌注(MCAO/R)大鼠模型神经功能的影响。方法 按照随机数字表法将雄性SPF级SD大鼠分为5组:青年假手术组、衰老假手术组、衰老MCAO/R组、空白血清干预的外泌体组及含药血清干预的外泌体组,每组15只。除青年假手术组外,其余各组通过每日腹腔注射D-半乳糖(500 mg/kg,连续8周)建立衰老大鼠模型。末次注射后,衰老MCAO/R模型组、空白血清干预的外泌体组及含药血清干预的外泌体组接受MCAO/R手术。采用差速离心法提取外泌体,经透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析系统(NTA)粒径分析仪及蛋白质印迹法鉴定后,于MCAO/R术后24、72 h,外泌体组经尾静脉注射等体积的空白血清干预外泌体或含药血清(10%)干预的外泌体。MCAO/R术后7 d取材。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色、Zea-Longa评分、Morris水迷宫实验分别检测脑梗死面积、神经功能缺损程度及学习记忆能力;采用HE染色、尼氏染色、高尔基-考克斯染色观察脑组织病理形态、尼氏体变化及神经元树突棘密度;利用免疫荧光及蛋白质印迹法检测神经元核抗原(NeuN)、微管相关蛋白2(MAP-2)蛋白表达情况。结果 与青年假手术组比较,衰老假手术组大鼠学习记忆能力下降,表现为逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短及穿越平台次数减少,同时尼氏体数量减少、神经元树突棘密度降低,NeuN和MAP-2蛋白表达水平下调(P<0.05);相较于衰老假手术组,衰老MCAO/R组大鼠神经功能缺损评分增加,逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短、穿越平台次数减少,梗死区脑组织神经元坏死,尼氏体数量减少,神经元树突棘密度降低,NeuN及MAP-2蛋白表达下降(P<0.05);与衰老MCAO/R组比较,空白血清干预的外泌体组与含药血清干预的外泌体组神经功能缺损评分降低,脑组织病理学改善,尼氏体数量增多,逃避潜伏期缩短、目标象限停留时间延长、穿越平台次数增加,神经元树突棘密度上调,NeuN和MAP-2蛋白表达上升(P<0.05),且含药血清干预的外泌体组改善效果均优于空白血清干预的外泌体组(P<0.05)。结论 芪芎左归复方可能通过调控骨髓间充质干细胞源性外泌体,缓解衰老MCAO/R大鼠的脑组织病理学变化及减轻神经元损伤,从而提高学习记忆能力及恢复神经功能。

关键词： 转录组测序   鸡巨噬细胞   脂多糖   双特异性磷酸酶1   抗原递呈  

摘要： 为研究鸡巨噬细胞(HD11)在脂多糖(LPS)刺激下,抑制双特异性蛋白磷酸酶1(DUSP1)表达对细胞抗原递呈的影响,试验以HD11为材料,将DUSP1siRNA片段转染到HD11中,转染48 h后,每孔添加1μg LPS,于0、2、4、6 h收集细胞并抽提总RNA进行转录组测序,并对差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)进行分析。结果显示:在LPS刺激的整个时间段,筛选到1 121个共同DEGs,其中564个上调,557个下调;KEGG通路富集发现,DEGs显著富集在4条信号通路中,与免疫反应密切相关的信号通路有细胞因子-细胞因子受体相互作用和TGF-β信号通路。DUSP1与免疫相关通路的27个DEGs进行基因互作网络分析,发现DUSP1与CD40、SMAD7、CCL4、IL15、IL10作用最为密切,其中CD40与抗原递呈密切相关。CD80、CD86、CD1C低表达,影响抗原递呈相关基因(MHCI家族、MHCII家族、CD4、CD8A)表达激活。研究提示:抑制DUSP1表达会降低CD40、CD80、CD86、CD1C表达,抑制HD11递呈LPS的能力。

关键词： 莲房多糖   宫颈癌HeLa细胞   转录组学   蛋白组学   机制   糖酵解通路  

摘要： 为研究莲房多糖(lotus seedpod polysaccharide,LSP)抑制宫颈癌HeLa细胞的作用及其机制,本研究采用试剂盒法、流式细胞术、细胞划痕愈合实验、Transwell细胞迁移及侵袭实验分析LSP对HeLa细胞的抑制作用。联合转录组学、蛋白组学及Western blot技术明晰LSP抑制HeLa细胞的可能机制。结果表明,LSP能显著降低HeLa细胞的细胞活力,影响其细胞形态,诱导细胞凋亡和线粒体膜电位崩塌,促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成,抑制细胞的迁移和侵袭。转录组学分析显示,120 μg/mL LSP能显著调节HeLa细胞的12 347 个基因表达(5 550 个上调、6 797 个下调),改变生物过程、分子功能和细胞组分,调控代谢路径、氧化磷酸化、化学致癌物-ROS、细胞周期等通路。蛋白组学分析显示,120 μg/mL LSP能显著调节HeLa细胞的1 143 个蛋白表达(379 个上调、764 个下调),改变了生物过程、分子功能和细胞组分,调控磷酸戊糖途径、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生、核苷酸代谢等通路。联合转录组学与蛋白组学分析显示,共同关联到的差异蛋白和差异基因有1 041 个,它们显著富集于糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢等通路。进一步选择糖酵解/糖异生通路展开研究发现,LSP显著降低HeLa细胞的ATP含量、葡萄糖消耗量和乳酸生成量,抑制己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性,下调糖酵解通路中葡萄糖-6-磷酸异构酶、血小板型磷酸果糖激酶、肌肉型磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶A、丙糖磷酸异构酶1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶1、磷酸甘油酸变位酶1、烯醇化酶1、烯醇化酶2、烯醇化酶3、丙酮酸激酶M、乳酸脱氢酶A和乳酸脱氢酶B的蛋白表达水平。综上,LSP对HeLa细胞具有显著抑制作用,这可能与其显著抑制糖酵解通路有关。本研究结果可为LSP在宫颈癌防治中的功能开发与高值化利用提供理论依据。

关键词： 鸽蛋   地方品种   常规蛋品质   氨基酸   脂肪酸   矿物元素  

摘要： 为系统发掘我国地方鸽种在鸽蛋营养品质方面的优异性,试验以海兰褐鸡蛋和引进品种白羽王鸽蛋为对照,通过多维度指标比较分析了广东石歧鸽、新疆塔里木鸽和江苏太湖点子鸽常规蛋品质及蛋清和蛋黄中粗蛋白、粗脂肪、肌苷酸、氨基酸、脂肪酸及矿物元素方面的差异。结果显示:不同禽蛋间蛋重、蛋壳颜色、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋黄颜色、蛋黄比率、蛋清比率和蛋壳比率均有显著差异(P<0.05)。与鸡蛋相比,鸽蛋重量小,蛋壳偏白,蛋壳薄、强度低,蛋黄颜色深,蛋清比例高。石歧鸽蛋重最大,显著高于太湖点子鸽和塔里木鸽蛋重(P<0.05)。石歧鸽蛋黄颜色显著低于其他品种鸽蛋(P<0.05)。太湖点子鸽蛋黄比率最高24.16%,显著高于其他品种鸽蛋(P<0.05)。塔里木鸽蛋壳比率显著高于其他品种鸽蛋(P<0.05),但蛋壳厚度却显著低于其他品种鸽蛋(P<0.05),蛋壳强度也显著低于白羽王鸽和石歧鸽(P<0.05)。不同禽蛋蛋清和蛋黄中粗蛋白、粗脂肪、肌苷酸和脂肪酸含量均无显著差异(P>0.05)。不同品种鸽蛋清中钙、磷含量均高于鸡蛋,其中白羽王鸽蛋清中钙含量显著高于鸡蛋(P<0.05),4种鸽蛋清中磷含量均显著高于鸡蛋(P<0.05),白羽王鸽蛋黄中铜含量显著高于其他禽蛋(P<0.05)。综上所述,鸽蛋壳厚度和强度不如鸡蛋,但鸽蛋在蛋液矿物质(如钙、磷)含量方面表现优于鸡蛋。不同鸽种之间石歧鸽蛋重量大,太湖点子鸽蛋黄占比大,白羽王鸽蛋矿物元素含量最高。

关键词： 猪流行性腹泻病毒   蛋白质纳米颗粒   基因工程技术   疫苗  

摘要： 猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染性疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。疫苗接种是预防PED的有效措施之一,随着PEDV毒株的持续变异,给临床上PED疫苗的研制带来了严峻挑战。蛋白质纳米颗粒疫苗具有生物安全性好、免疫原性强以及可精准递呈抗原表位等优势,是新型疫苗研发的重要方向。近年来,基于病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)、铁蛋白(Ferritin)、AP205及mi3等自组装纳米载体的PEDV蛋白质纳米颗粒疫苗研究取得重要进展。本文系统综述了基于PEDV S蛋白为核心抗原的疫苗设计,重点阐述了基于结构蛋白自组装VLPs、基因融合策略构建的纳米颗粒及SpyCatcher/SpyTag抗原展示系统构建纳米颗粒疫苗的研究进展,并展望了多价嵌合型纳米颗粒设计、靶向保守抗原S2亚基及黏膜免疫增强策略等未来研究方向,旨在为开发安全、高效、广谱的PEDV新型疫苗提供理论参考。

关键词： α-淀粉酶   多糖肉桂醛   荷斯坦阉牛   瘤胃组织形态   肌内脂肪沉积   微生物区系  

摘要： 【目的】旨在研究α-淀粉酶(α-amylase,AM)、多糖肉桂醛(polysaccharide-cinnamaldehyde,PC)对荷斯坦阉牛生产性能、瘤胃组织形态及微生物区系的影响,为荷斯坦阉牛育肥后期高效、健康的营养调控饲养方案提供理论依据。【方法】选取健康、体重相近(614.28 kg±42.61 kg)的16月龄荷斯坦阉牛21头,随机分为3组,每组7个重复,每个重复1头。对照组(CK组)阉牛饲喂基础饲粮,α-淀粉酶组(AM)饲喂基础饲粮+0.6 g/kg AM,α-淀粉酶+多糖肉桂醛组(APC)饲喂基础饲粮+0.6 g/kg AM+1 g/kg PC。试验期为75 d,包括15 d预试期,60 d正试期。正试期第1和60天测定试验牛的体重,计算平均日增重。记录每头牛每天的采食量,计算干物质采食量和料重比。饲养试验结束后,将每组7头牛进行屠宰。采集背最长肌,测定肌内脂肪含量。采集瘤胃上皮组织进行形态观察。收集瘤胃内容物,测定瘤胃液pH,并用于高通量测序分析瘤胃微生物组成,过滤后采集瘤胃液测定挥发性脂肪酸含量。【结果】与CK组相比,APC组阉牛背最长肌的肌内脂肪含量显著提高(P<0.05),各组其余生长性能指标均无显著差异(P>0.05)。各组阉牛瘤胃乳头高度无显著差异(P>0.05);与CK组相比,AM组阉牛瘤胃乳头宽度、角化层厚度显著降低(P<0.05),固有膜宽度极显著降低(P<0.01)。各组阉牛瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸、异戊酸、戊酸比例及乙酸∶丙酸均无显著变化(P>0.05);与CK和AM组相比,APC组阉牛瘤胃pH显著升高(P<0.05)。与CK和AM组相比,APC组阉牛瘤胃中总挥发性脂肪含量具有降低趋势(P=0.055),异丁酸比例具有升高趋势(P=0.088)。在门、属水平,与CK组相比,APC组阉牛瘤胃中纤维杆菌门(Fibrobacteres)与纤维杆菌属(Fibrobacter)相对丰度均显著降低(P<0.05)。随机森林分析结果显示,白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、脱硫弧菌属D168(Desulfovibrio D168)是3组荷斯坦阉牛瘤胃中的差异标志物种。RDA分析结果显示,乙酸∶丙酸与白色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、脱硫弧菌属D168均呈负相关;白色瘤胃球菌与产琥珀酸丝状杆菌之间呈现负相关关系。【结论】在本试验条件下,饲粮中单独添加0.6 g/kg AM对阉牛瘤胃组织形态参数有显著负面影响,但联合添加0.6 g/kg AM与1.0 g/kg PC,可有效改善阉牛瘤胃健康与发酵模式,并显著提升阉牛背最长肌的肌内脂肪含量。