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关键词： 葡萄根结线虫   效应蛋白MvDN4778   基因克隆   功能分析  

摘要： 【目的】分离鉴定葡萄根结线虫（Meloidogyne vitis）的效应蛋白并研究其功能，为葡萄根结线虫病防治策略的研发提供基因靶点和数据支撑。【方法】基于葡萄根结线虫RNA-Seq数据，采用生物信息学技术筛选并预测潜在效应蛋白，通过Expasy-ProtParam、SignalP 6.0等软件对挖掘到的效应蛋白的结构特征进行分析。根据目标效应蛋白基因CDS区序列设计特异性引物，通过PCR克隆技术克隆目标效应蛋白基因；进一步运用农杆菌介导的烟草瞬时表达、原位杂交及荧光定量PCR技术，探索目标效应蛋白的功能。【结果】从葡萄根结线虫中挖掘到1个未知功能的候选效应蛋白，克隆到其基因MvDN4778，其序列全长564 bp，编码187个氨基酸，蛋白质分子量为2.0 kD；结构特征分析显示，该蛋白N端含有24个氨基酸大小的信号肽，无跨膜结构域，含1个由2个氨基酸组成的单分型核定位信号；原位杂交结果表明，该蛋白基因MvDN4778在亚腹食道腺细胞特异表达；荧光定量检测显示其在侵染后2龄幼虫（second-stage juvenile，J2）和雌成虫阶段有高表达；瞬时表达试验证实，该效应蛋白MvDN4778可抑制植物PTI免疫反应激发子BAX、NPK1和植物ETI免疫反应激发子R3a/Avr3a激发的烟草叶片坏死反应，明确其具有免疫调控相关的潜在功能。【结论】明确了MvDN4778是葡萄根结线虫亚腹食道腺分泌的效应蛋白，具备抑制寄主植物免疫反应的功能，推测其可能在调控线虫寄生进程、促进线虫成功侵染寄主体内发挥关键作用。

关键词： 肝细胞癌   沉默信息调节因子5   谷胱甘肽硫转移酶M1   蛋白质翻译后修饰   丙二酰化修饰   琥珀酰化修饰  

摘要： 目的 肝细胞癌占原发性肝癌90%以上，外科手术是治疗肝细胞癌的主要治疗方法。近年来免疫治疗，包括免疫检查点抑制剂和过继性细胞治疗的突破为不可手术的肝细胞癌患者提供了替代治疗方案，但肝细胞癌患者的复杂遗传异质性和代谢异质性制约了治疗效果。方法 通过蛋白质印迹法分析了肝细胞癌临床标本中的蛋白质赖氨酸酰基化水平及沉默信息调节因子5（silence information regulator 5；SIRT5）表达水平，通过基于CRISPR-Cas9的基因编辑技术构建了在肝组织中特异性过表达SIRT5的转基因小鼠，并以此建立原发肝癌模型，以分析肝组织SIRT5在原发性肝癌发生发展中的作用。结果 发现SIRT5在肝细胞癌临床标本中表达水平升高，其表达水平与蛋白质赖氨酸酰基化水平降低相关。蛋白组学分析及生物信息学分析表明，肝细胞癌组织中与代谢、生物合成、解毒及氧化还原稳态相关蛋白质的酰基化修饰（包括丙二酰化修饰、琥珀酰化修饰）发生改变，并进一步通过蛋白质修饰分析及酶活性分析证明谷胱甘肽硫转移酶M1 (glutathione S-transferase Mu 1；GSTM1)的活性受丙二酰化修饰影响。在肝组织中特异性过表达SIRT5加速二乙基亚硝胺引发的肝组织纤维化，促进肝细胞癌的发生和发展。结论 SIRT5通过擦除GSTM1等关键酶的酰基化修饰而影响肝细胞代谢及氧化还原稳态，从而促进肝细胞癌的发生发展。干预蛋白质酰基化修饰可能对于肝细胞癌的免疫治疗带来新的机遇。

关键词： 北沙参多糖   超声辅助酶法   响应面法   提取工艺   MNNG诱导损伤模型  

摘要： 为优化北沙参多糖（GLP）的提取工艺，提高多糖提取率及其活性，利用超声辅助酶法提取GLP，系统评估了多种酶制剂对多糖提取效率、组分含量，体内抗炎活性及体外胃黏膜细胞保护活性的影响；随后，通过单因素试验结合Box-Behnken响应面分析对提取参数进行系统优化；进一步采用Sevage法对GLP进行纯化，并测定其中多糖及蛋白质的含量。结果表明，果胶酶提取物在CuSO4诱导的斑马鱼炎症模型、MNNG和乙醇诱导的人胃黏膜细胞（GES-1）损伤模型中分别表现出显著的抗炎和胃黏膜细胞保护活性，特别是在乙醇诱导的GES-1细胞损伤模型中的活性优于其他酶提取物。GLP的最优提取条件为果胶酶添加量0.44%，超声时间39 min，提取温度50 °C，料液比1:30。该条件下多糖提取率达37.17%；经纯化后，GLP中多糖含量为60.8%，蛋白质残留量为0.243%。超声辅助果胶酶法不仅能高效制备GLP，而且所得多糖具有显著的抗炎与胃黏膜细胞保护活性，为其在功能性食品领域的开发提供了可靠的依据。

关键词： 大豆肽-EGCG偶联物   大豆多糖   β-胡萝卜素   递送体系   生物利用度  

摘要： 类胡萝卜素类脂溶性化合物在加工与消化过程中的化学不稳定性和低生物利用度限制了其在食品中的应用。本研究旨在构建一种大豆基来源的营养素递送体系，通过大豆肽-表没食子儿茶素没食子酸酯共价偶联物（大豆肽-EGCG偶联物）与大豆多糖（SSPS）的协同组装，提升对β-胡萝卜素的加工稳定性及生物利用度。采用碱法诱导共价偶联制备大豆肽-EGCG偶联物，通过对油脂和多糖种类、大豆肽-EGCG偶联物-多糖配比及超声参数的筛选与优化，构建了具备良好分散性的三元递送体系。结果表明，当以大豆油为油相，大豆肽-EGCG偶联物与SSPS质量比为1:2，在480 W功率下超声处理20 min时，三元体系呈现出最优的微观结构与界面稳定性。该三元体系在常温储藏7 d内表现稳定，β-胡萝卜素保留率高于(93.51 ± 0.93)%；在90 ℃热处理30 min后保留率仍维持在(65.02 ± 0.14)%，其保护效果均显著优于单一组分递送体系。体外模拟消化研究表明，致密的复合界面产生空间屏蔽效应，限制了脂肪酶对脂质的接触频率，使游离脂肪酸释放曲线趋于平缓，β-胡萝卜素的生物利用度保持在(41.10 ± 2.36)%。本研究构建的大豆源三元递送体系可有效保护脂溶性营养素在加工与消化过程中的稳定性，为高稳定性全植物基功能食品的开发提供了新策略与理论参考。

关键词： 纳米化金合欢素   脓毒症   心肌病   脂多糖   Wnt/β-catenin   信号通路  

摘要： 目的 本研究旨在探讨纳米化金合欢素（Nano acacetin,Nano AC）在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导的H9c2细胞损伤中的作用及机制。方法 采用分子生物学方法，检测Nano AC抑制LPS诱导的H9c2细胞损伤：以相同浓度的游离金合欢素（Acacetin,AC）和Nano AC干预由LPS(10μg/mL)诱导的H9c2细胞损伤；采用CCK-8法检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞凋亡率，采用ELISA法检测心肌损伤标志物（cTnI、CK-MB）及炎症因子（IL-6、IL-1β、TGF-β、IL-10）水平，采用免疫荧光法测定活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位（ΔΨm），采用比色法检测谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及三磷酸腺苷（ATP）水平。利用转录组测序法筛选差异基因，并用Wnt信号通路抑制剂XAV939进行干预，检测Wnt1和β-catenin的蛋白表达水平、细胞存活率、氧化应激状态和线粒体功能相关指标，验证Nano AC的作用机制。结果 与LPS组相比，AC和Nano AC可提高细胞存活率：AC组升高为74.8%±6.0%,Nano AC组升高为94.0%±5.0%,P<0.05；降低凋亡率：AC组下降为25.1%±2.0%,Nano AC组下降为19.4%±0.5%,P<0.05。AC和Nano AC可下调cTnI、CK-MB和IL-6、IL-1β、TGF-β水平，P<0.05；上调IL-10水平，P<0.05。Nano AC的作用比AC更显著。Nano AC减少ROS、MDA生成，P<0.05；提高GSH、SOD活性及ATP水平，P<0.05；逆转ΔΨm的下降，P<0.05。转录组分析显示，Nano AC逆转相关差异基因主要富集于Wnt信号通路。实验证实：Nano AC上调Wnt1、β-catenin蛋白表达水平；使用Wnt信号通路抑制剂XAV939发现，XAV939可逆转Nano AC的保护作用。结论 Nano AC可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制由LPS诱导的H9c2细胞损伤。

关键词： 蒙花苷   自组装   纳米粒   Box-Behnken设计-效应面法   溶解度   释药行为   药动学   生物利用度   急性毒性  

摘要： 目的 制备香菇多糖-蒙花苷自组装纳米粒（lentinan-buddleoside self-assembled nanoparticles，Len-Bud-SANs），考察理化性质及口服药动学行为，并评价急性毒性。方法 采用自组装法制备Len-Bud-SANs。以包封率、载药量和粒径为指标，单因素实验结合Box-Behnken设计-效应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）优化Len-Bud-SANs处方工艺。透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）观察Len-Bud-SANs外貌形态，X射线粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）法分析Len-Bud-SANs粉末晶型。分子模拟对接和傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）研究香菇多糖和蒙花苷结合机制。测定Len-Bud-SANs在pH 2.0和pH 6.8磷酸盐缓冲液（PBS）中溶解度及释药行为。SD大鼠分别ig给予蒙花苷和Len-Bud-SANs粉末，HPLC法测定血药浓度，计算主要药动学参数。以体质量、摄食量、胸腺指数和脾脏指数为指标，对Len-Bud-SANs粉末进行安全性评价。苏木精-伊红（HE）染色观察SD大鼠重要器官病理情况。结果 Len-Bud-SANs最佳处方：香菇多糖质量分数为0.39%，制备温度为65.00 ℃，制备时间为1.50 h。Len-Bud-SANs的包封率、载药量、粒径和ζ电位分别为（88.57±0.83）%、（8.02±0.11）%、（57.54±4.90）nm和（-32.10±1.36）mV。Len-Bud-SANs微观外貌为球形，蒙花苷在Len-Bud-SANs粉末中转变为无定形态。Len-Bud-SANs在pH 2.0和pH 6.8 PBS中溶解度分别提高至59.89倍和42.95倍，累积释放率分别提高至90.80%和91.73%，释药过程符合Weibull模型。药动学结果显示，Len-Bud-SANs半衰期(t1/2)增加至（4.45±0.80）h，血药浓度(Cmax)和时间曲线下面积(AUC0～t)分别提高至3.00倍和5.60倍。与空白组相比，Len-Bud-SANs组体质量、摄食量、胸腺指数、脾脏指数及重要器官病理均无明显变化。结论 Len-Bud-SANs显著促进了蒙花苷口服吸收，未见明显毒性，为后续开发研究奠定基础。

关键词： 多房棘球蚴   增殖细胞核抗原   序列   分析   基因   克隆   表达   纯化  

摘要： 目的 分析多房棘球蚴（echinococcus multilocularis,Em）增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）基因序列，鉴定原核产物，检测Em-PCNA重组蛋白与AOH1996的亲和力。方法 使用TMHMM、SOPMA等生信网站分析Em-PCNA基因序列。提取多房棘球蚴总RNA，经反转录合成cDNA，通过PCR技术对Em-PCNA基因进行特异性扩增，将成功扩增的Em-PCNA基因克隆至pET28a（+）载体上，并进一步转化至大肠埃希菌Rosetta（DE3）进行Em-PCNA基因片段蛋白的原核表达，将异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，采用Ni-NTA亲和层析技术进行纯化，采用SDS-PAGE、Western Blot法进行鉴定。通过微量热泳动（MST）法检测Em-PCNA重组蛋白与AOH1996的亲和力。结果 基因序列分析表明，Em-PCNA含260个氨基酸，等电点为5.71；蛋白结构分析显示，Em-PCNA具有PCNA超家族结构与保守功能结构域；系统进化分析显示，Em-PCNA与带科绦虫聚于一类，与人和犬、牛、旋毛虫亲缘关系较远。将构建的原核表达载体pET28a-Em-PCNA转化为Rosetta（DE3）后，经IPTG诱导，成功表达EmPCNA重组蛋白，且以可溶性形式表达，分子量约为36 ku，与理论分子量大小基本一致。分子对接结果显示，Em-PCNA与AOH1996的最低结合能为-6.20 kcal·mol-1，结合氢键键长为2.6?；Em-PCNA重组蛋白与AOH1996结合的解离常数（Kd）为（37.55±4.69）nM。结论 明确了EmPCNA基因序列，有效鉴定了原核产物，得出了Em-PCNA重组蛋白与AOH1996具有较强亲和力的结论。

关键词： 小麦   TaZIP7   籽粒锌含量   生物信息学   激素结合位点和磷酸化位点   转录本表达量  

摘要： TaZIP7是一类小麦锌指蛋白。鉴于TaZIP7基因与小麦籽粒锌含量高度相关，本研究以9份锌含量差异显著的春小麦品种为材料，对TaZIP7基因全长(包括启动子区和3'UTR)和编码区序列进行了克隆和分析，并对该基因在成熟籽粒中转录本的表达特性进行研究，以期为小麦锌营养品质遗传改良提供基因资源与理论依据。结果显示，小麦TaZIP7-A、TaZIP7-B和TaZIP7-D的编码序列全长分别为1 092 bp、1 161 bp和1 161 bp。推导氨基酸序列分析表明，其均为分泌疏水性不稳定蛋白，且定位于细胞膜，具有7个跨膜区域，并含有30个磷酸化位点，提示TaZIP7-A、TaZIP7-B和TaZIP7-D的编码序列可能通过翻译后修饰参与功能调控。另外，在TaZIP7-A、TaZIP7-B和TaZIP7-D的启动子区，有多种激素与逆境响应元件，表明该基因可能整合多种信号通路以调控锌稳态以及广泛参与非生物胁迫响应。本研究共获得TaZIP7基因的20个等位基因，其中，TaZIP7-A、TaZIP7-B与TaZIP7-D分别鉴定出5、6、9个等位基因。进一步对成熟籽粒中TaZIP7的转录本分析发现，TaZIP7-A、TaZIP7-B和TaZIP7-D的转录本表达量在锌含量高的小麦品种中均显著高于锌含量低的小麦品种，表明TaZIP7-A、TaZIP7-B和TaZIP7-D在籽粒中的表达量与籽粒锌含量可能呈正相关。这些研究结果有助于进一步解析TaZIP7基因在小麦中的功能，同时为小麦中TaZIP7优异等位基因的育种利用提供重要依据。

关键词： 一枝黄花多糖   超声波提取   响应面法   抗氧化   抗炎  

摘要： 本研究旨在优化一枝黄花多糖（SDP）的超声提取工艺，并初步探究其抗氧化与抗炎活性。以多糖得率为指标，采用单因素试验结合Box-Behnken响应面法，考察料液比、提取时间、超声功率对提取效果的影响。通过DPPH·、·OH、·O2-清除率及还原力测定，综合评价一枝黄花多糖的抗氧化活性；采用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症模型，以CCK-8法检测细胞活性，以Griess法检测NO释放量，综合评价一枝黄花多糖的抗炎活性。结果显示，多糖最优提取工艺为料液比1∶27.39、提取时间150 min、超声功率305.39 W，在此条件下，SDP实际得率为（6.85±0.02）%，与模型预测值（6.98%）接近，表明该优化工艺稳定可靠；红外光谱分析证实提取物具有典型多糖特征吸收峰；SDP呈浓度依赖性地清除DPPH·、·OH、·O2-等自由基，并具有较强的还原力；在LPS诱导的RAW264.7细胞模型中，低剂量（250 μg/mL）、中剂量（500 μg/mL）SDP均可显著提高细胞活性，低剂量（250 μg/mL）、中剂量（500 μg/mL）、高剂量（1 000 μg/mL）SDP均可显著抑制NO释放。综上可知，优化所得SDP提取工艺高效稳定，所得多糖具备良好的体外抗氧化活性及抗炎活性，能够缓解LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。本研究为一枝黄花多糖在功能性食品、天然药物及抗炎抗氧化产品中的进一步开发提供了试验依据与理论支持。

关键词： 单细胞蛋白质组学   细胞打印   质谱  

摘要： 蛋白质作为生命活动的直接执行者，其表达与翻译后修饰特征是细胞功能异质性的直接体现。传统群体细胞蛋白质组学因平均效应难以捕捉细胞间的细微差异，而单细胞水平解析对精准医学和细胞生物学领域的发展至关重要。本研究采用细胞打印技术实现单细胞蛋白质组学样品的快速制备：将裂解液打印至96孔板后，分选A549/HeLa单细胞并进行酶解与酸化处理；通过Vanquish Neo-Orbitrap Astral系统开展数据非依赖性采集（DIA），并在Spectronaut软件中完成数据分析。结果显示，2种细胞在单细胞水平共鉴定到6 072个蛋白质群组和41 577条肽段，蛋白质丰度既存在高相关性，又保持异质性特征；基因本体（GO）分析表明，所鉴定的蛋白质空间分布无偏性。该方法最大限度地减少了细胞活性丧失与蛋白质降解，缩短了实验时间并提高了检测通量，有助于推动基于质谱的单细胞蛋白质组学技术发展，为解析复杂生物系统提供了有力支撑。