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关键词： 牛肠道病毒(BEV)   VP3蛋白   原核表达   多克隆抗体  

摘要： 【目的】利用原核表达系统制备牛肠道病毒(Bovine enterovirus,BEV)VP3蛋白,并以其为免疫原制备多克隆抗体,为后续研究BEV VP3功能及BEV防控相关生物制品研制奠定基础。【方法】以pBluescript SK(-)-BEV 3531重组质粒为模板,通过PCR扩增BEV VP3基因,连接至pCold原核表达载体,构建含His标签的pCold-VP3重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,利用IPTG进行诱导表达,经过超声破碎和Ni-NTA亲和层析纯化,获得重组BEV VP3蛋白。纯化后的蛋白经梯度透析复性后用于免疫小鼠制备多克隆抗体。通过ELISA、Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及血清中和试验分别对多克隆抗体的效价、反应性、特异性及病毒中和活性进行鉴定。【结果】成功扩增获得长度为729 bp的BEV VP3基因。重组BEV VP3蛋白主要以包涵体形式表达,分子质量约30.7 ku。纯化后蛋白稳定,复性效果良好。间接ELISA结果表明,免疫小鼠所得多克隆抗体效价为1∶12 800以上;Western blotting结果表明,该抗体可在BEV感染细胞中特异性识别VP3蛋白;IFA结果表明,该抗体可清晰标记BEV感染细胞,显示出良好的特异性和敏感性;血清中和试验结果表明,该抗体能明显抑制BEV感染细胞,说明其具有一定的病毒中和活性。【结论】本研究成功制备了高纯度、具有免疫活性的重组BEV VP3蛋白及其多克隆抗体,为进一步建立BEV VP3相关ELISA血清学检测方法、开发亚单位疫苗及探讨BEV感染中VP3的作用提供了可靠的试验材料。

关键词： 间充质干细胞   癫痫   干细胞移植   神经修复   抗炎特性  

摘要： 癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,传统抗癫痫发作药物(Anti-seizure Medications,ASMs)治疗对约1/3患者无效,成为药物难治性癫痫(drug-resistant epilepsy,DRE)。近年来,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因其多向分化及修复潜能、免疫调节特性和神经保护作用,在癫痫治疗领域展现出广阔前景。本文综述了MSCs治疗癫痫的最新研究进展,包括其抗炎、神经营养、突触调节、神经发生促进等作用机制,骨髓、脂肪组织、脐带、嗅黏膜、外泌体等不同来源MSCs的比较研究,临床前动物模型研究结果、初步临床试验数据及移植后细胞存活、迁移和分化情况的监测方法,同时探讨了MSCs治疗面临的挑战及可能的解决方案。

关键词： 盖塔病毒   感染性克隆   病毒拯救   噬斑   间接免疫荧光试验  

摘要： 【目的】建立盖塔病毒(Getah virus,GETV)反向遗传系统,以探究其致病机制,从而为后续疫苗和抗病毒制品研发提供科学依据。【方法】以GETV-JX-CHN-22-P7毒株为对象,构建cDNA感染性克隆反向遗传系统。先将所需元件连入pBeloBAC11载体,获得GETV感染性克隆中间质粒。针对GETV基因组序列设计引物,分2段扩增GETV基因组,并分别克隆至感染性克隆系统质粒pBeloBAC11,获得含有GETV-JX-CHN-22-P7毒株基因组全长的感染性克隆质粒(pGETV)。将pGETV转染Vero 81细胞进行病毒拯救,直至观察到典型病变。对拯救成功的病毒进行连续传代、鉴定、生长特性以及遗传稳定性验证。【结果】GETV-JX-CHN-22-P7基因组片段扩增后插入pBeloBAC11,成功构建cDNA感染性克隆质粒pGETV。将pGETV转染Vero 81细胞后,48 h可观察到典型细胞病变,细胞变圆脱落,收集细胞上清,获得感染性克隆病毒。分别提取感染性克隆病毒和野生型病毒基因组RNA,对病毒基因组进行RT-PCR扩增、基因序列测定。结果表明,与野生型病毒相比,拯救病毒含有稳定的分子遗传标记。蛋白免疫印迹和间接免疫荧光试验结果均表明感染性克隆病毒拯救成功,命名为rGETV-JX-CHN-22-P7。噬斑形成试验和一步生长曲线试验结果表明,感染性克隆病毒与野生型病毒具有相似的复制能力和增殖特性。此外,感染性克隆病毒在Vero 81细胞连续传代至20代的测序结果表明,该感染性克隆病毒具有良好的遗传稳定性。【结论】成功构建了稳定、高效的GETV-JX-CHN-22-P7毒株全长cDNA感染性克隆,为GETV致病机理研究以及新型疫苗开发奠定了基础。

关键词： 反刍家畜   胚胎发育   上胚层   多能干细胞  

摘要： 多能干细胞(Pluripotent stem cells, PSCs)在临床医学和动物育种中具有广阔的应用前景。牛、羊是我国畜牧业中重要的反刍家畜,近年来,研究人员通过解析早期胚胎发育和多能性调控机制,成功建立了稳定的牛、羊上胚层干细胞系,所建立的细胞系能够维持胚胎上胚层多能性状态,具有典型干细胞的分子特征,并且在长期传代过程中仍能保持基因组的稳定。本文综述了牛、羊附植前胚胎发育特点及关键发育事件,揭示了早期胚胎命运决定和分化机制;阐述了胚胎上胚层的多能性状态呈现从初始态、形成态至激发态的转变,抑制WNT信号和激活FGF信号是实现形成态和激发态PSCs稳定培养的关键。然而,具备生殖系嵌合能力的初始态PSCs在家畜中尚未成功获得,仍是亟待解决的难题。最后,本文进一步对家畜PSCs在基础研究、类胚胎模型构建、优良畜种培育等领域的应用前景进行了展望,以期为反刍家畜干细胞的建立和应用提供理论参考。

关键词： 核酸适体   杂交链式反应循环   DNA酶   超灵敏检测   抗生素  

摘要： 功能核酸探针具有高特异性、高亲和力、高稳定性、低成本等优势,本实验将分子识别与分子循环等科研思维通过设计实验和优化应用流程的方式引入本科实验教学中,设计了双重信号放大的功能核酸探针,以核酸适体作为识别单元,通过杂交链式反应与脱氧核酶放大,以硫黄素与G-四链体结合的荧光信号实现水中氯霉素的超灵敏检测。

关键词： 紫贻贝   四溴双酚A   磺基转移酶   RNA干扰  

摘要： 为探究紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)SULT1B1基因响应四溴双酚A(TBBPA)胁迫的生物学功能,采用生物信息学技术解析该基因序列特征并进行进化分析,利用qRT-PCR检测其在各组织表达水平,继而设置RNA干扰实验,检测紫贻贝中TBBPA及其代谢产物的含量。结果表明:SULT1B1基因完整CDS序列为894 bp,编码297个氨基酸,磺基转移酶核心结构域Sulfotransfer-1覆盖了该蛋白的51~287位氨基酸;该蛋白分子质量为34.63 kU,等电点为7.58,亲脂指数为69.60。进化分析显示,SULT1B1蛋白高度保守并与脊椎动物明显分化。SULT1B1基因在紫贻贝消化腺中表达量最高,这暗示其主要在消化腺中发挥作用。此外,RNA干扰处理后,紫贻贝体内TBBPA含量显著增多,这说明该基因对TBBPA的代谢具有重要作用,并成功鉴定到了6种TBBPA代谢产物,初步明确了TBBPA在紫贻贝体内的主要代谢途径。本研究为深入探究紫贻贝对TBBPA的解毒机制提供了理论依据。

关键词： 琼胶寡糖   瘤胃上皮细胞   紧密连接蛋白   凋亡   脂多糖  

摘要： 本试验旨在探究琼胶寡糖(AOS)对脂多糖(LPS)诱导瘤胃上皮细胞损伤的缓解作用及其机理。首先通过0、50、100μg/mL的LPS作用于瘤胃上皮细胞24 h来筛选最佳的LPS浓度并建立细胞损伤模型,然后设置0和15μg/mL的AOS来探究AOS对瘤胃上皮细胞的毒性影响;在此基础上,试验设置3个组,对照组用不含AOS和LPS的培养基培养细胞42 h,L组和A+L组分别用0和15μg/mL AOS培养基培养细胞18 h,然后加入50μg/mL LPS刺激细胞24 h。干预结束后,分别检测细胞紧密连接蛋白和凋亡相关基因的mRNA相对表达量及Toll样受体4(TLR4)/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路相关蛋白的相对表达量。结果表明:1)与0μg/mL LPS(对照)相比,50μg/mL LPS显著降低闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、封闭蛋白-1(Claudin-1)、Occludin和B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的mRNA相对表达量以及Bcl-2/B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白(BAX)的值(P<0.05),显著增加BAX的mRNA相对表达量(P<0.05)。2)与0μg/mL AOS(对照)相比,15μg/mL AOS显著提高Claudin-1、Occludin和Bcl-2的mRNA相对表达量以及Bcl-2/BAX的值(P<0.05),显著降低BAX的mRNA相对表达量(P<0.05)。3)与L组相比,A+L组ZO-1、Claudin-1、Occludin、封闭蛋白-4(Claudin-4)、Bcl-2的mRNA相对表达量显著提高(P<0.05),半胱天冬蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱天冬蛋白酶-8(Caspase-8)、B淋巴细胞瘤-2相关死亡促进因子(BAD)和半胱天冬蛋白酶-9(Caspase-9)的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05);与L组相比,A+L组TLR4和髓样分化因子88(MyD88)的蛋白相对表达量以及细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶的相对磷酸化水平显著降低(P<0.05)。综上所述,AOS可通过调控紧密连接蛋白及凋亡相关基因的表达,并抑制MAPK信号通路,从而缓解LPS诱导的瘤胃上皮细胞损伤。

关键词： 群体感应   荚膜多糖   AI-2   副干酪乳酪杆菌CCFM1073   没食子酸丙酯  

摘要： 在高密度发酵产业化过程中,副干酪乳酪杆菌CCFM1073因过度合成荚膜多糖导致发酵液黏稠、菌体离心回收困难,制约其产业化应用。为解决上述问题,该研究提出通过添加群体感应抑制剂来干扰细菌的群体感应系统,进而调控其荚膜多糖合成并改善离心性能。研究采用发酵罐培养,结合活菌计数、荚膜多糖含量测定及群体感应信号分子Autoinducer-2 (AI-2)的活性检测,筛选并优化了群体感应抑制剂的添加浓度。结果表明,添加0.15 g/L的没食子酸丙酯可显著改善离心效率,使单位菌体荚膜多糖含量由(6.08 ± 0.16)× 10-12 mg/CFU降到(5.21 ± 0.22)× 10-12 mg/CFU,活菌数达(68.33 ± 5.51)× 108 CFU/mL。进一步分析显示,该处理可降低AI-2信号活性,并伴随群体感应相关基因luxS与pfs,以及荚膜多糖合成基因簇中epsC、epsD、epsJ和WbbL的转录水平下调。该研究揭示了通过群体感应系统调控细菌荚膜多糖合成的可行性,为化解副干酪乳酪杆菌发酵产业中的离心难题提供了理论基础和具有应用潜力的新策略。

关键词： 树突状细胞   氨基酸代谢   免疫代谢  

摘要： 树突状细胞(dendritic cells, DCs)是体内专职抗原呈递细胞,通过捕获、加工和呈递抗原,诱导初始T细胞的活化与分化,启动免疫应答反应。DCs的能量代谢具有高度可塑性。静息状态下,DCs主要依赖氧化磷酸化供能;激活后,DCs主要依赖糖酵解功能,同时脂质代谢也部分参与调控DCs抗原呈递和细胞因子分泌。氨基酸能量代谢广泛参与调控DCs的生理功能,包括谷氨酰胺分解为三羧酸循环提供中间产物、色氨酸代谢通过犬尿氨酸途径诱导免疫抑制、精氨酸代谢参与一氧化氮生成等,这些过程均参与DCs的成熟分化和免疫调节。病理条件下,DCs氨基酸代谢紊乱促进代谢性疾病(如肥胖、2型糖尿病)和心血管疾病(如动脉粥样硬化、心肌梗死)的发生发展。靶向调控DCs氨基酸转运或代谢有望成为改善上述疾病免疫微环境的潜在治疗策略。深入解析DCs代谢稳态的调控机制,尤其是氨基酸能量代谢,可望拓展免疫代谢交叉领域相关理论,并为相关疾病的防治提供新的理论依据和干预靶点。本文系统综述了氨基酸对DCs功能的调控机制,重点探讨其在抗原呈递、免疫调控及疾病治疗中的作用,并总结了基于氨基酸能量代谢的干预策略,为相关领域研究和应用提供新思路。

关键词： 香格里拉矮山羊   肉品质   氨基酸   脂肪酸  

摘要： 本试验旨在研究香格里拉矮山羊肉的品质特性和营养组成情况。试验选择12月龄、体况良好、体重相近(21.34 kg±3.92 kg)的香格里拉矮山羊24只,其中公、母羊各12只,屠宰后采集背最长肌分别进行肉品质指标测定和营养成分含量分析。结果表明:香格里拉矮山羊公羊肉的黄度(b*)值、熟肉率均显著低于母羊(P<0.05),剪切力极显著高于母羊(P<0.01);肌肉中的水分、粗蛋白质、粗灰分、粗脂肪和胆固醇含量在公、母羊之间差异均不显著(P>0.05),但公羊肉中的粗脂肪和胆固醇含量比母羊分别低21.05%和9.89%;公羊肌肉中磷、铁、铜的含量均显著低于母羊(P<0.05),镁含量略低于母羊(P=0.052),钙、钾和锌含量在公、母羊之间差异均不显著(P>0.05);公、母羊肌肉中检测出16种氨基酸,其中谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和亮氨酸的含量较高,必需氨基酸(EAA)、非必需氨基酸(NEAA)和总氨基酸(TAA)含量在公母羊肌肉中均无显著差异(P>0.05),EAA/TAA公、母羊平均为43.74%,EAA/NEAA平均为77.74%;公、母羊肌肉中的饱和脂肪酸(SFA)、不饱和脂肪酸(UFA)含量均无显著差异(P>0.05),公羊肌肉中的多不饱和脂肪酸(PUFA)含量比母羊高18.40%,但两者差异不显著(P>0.05);公羊肌肉中的反式油酸(C18:1n9t)含量极显著高于母羊(P<0.01),而二十二碳六烯酸(C22:6n3)含量极显著低于母羊(P<0.01)。综上所述,香格里拉矮山羊肉品质较优且富含多种矿物质、氨基酸和脂肪酸,其中母羊肌肉嫩度更高,保水性更好,矿物质含量较高,富含二十二碳六烯酸;公羊肌肉粗脂肪和胆固醇含量较低,PUFA含量较高。