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关键词： 三角帆蚌   Nrf2调控   特异性表达   启动子分析   多克隆抗体   氧化应激  

摘要： 【目的】克隆并鉴定三角帆蚌NAD(P)H醌氧化还原酶1基因(HcNQO1),并探讨三角帆蚌Nrf2(HcNrf2)对它的调控机制。【方法】采用快速扩增cDNA末端技术克隆HcNQO1的全长cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析HcNQO1 mRNA的组织特异性表达模式。采用高效热不对称交错PCR扩增HcNQO1的启动子序列,并通过双荧光素酶报告实验鉴定启动子中的Nrf2结合位点。此外,采用蛋白质免疫印迹检测HcNQO1蛋白在不同组织中的表达水平。【结果】HcNQO1的开放阅读框长1005 bp,编码264个氨基酸。序列比对分析显示,HcNQO1与其他双壳类动物的同源蛋白具有高度保守性。RTqPCR结果显示,HcNQO1 mRNA在多个组织中均有表达,且在性腺和鳃中的表达水平显著高于其他组织。成功获得HcNQO1启动子区域上游的序列(1109 bp),并进一步鉴定出其中2个抗氧化反应元件,证实其对HcNrf2的结合具有关键作用。此外,本研究制备了针对HcNQO1蛋白的多克隆抗体,并发现该蛋白在不同组织中的表达水平与其mRNA表达水平存在一定差异。【结论】综上所述,本研究成功克隆并鉴定了三角帆蚌的HcNQO1,揭示了其与HcNrf2的相互作用机制。研究结果为深入理解双壳类动物NQO1的生物学功能及其在氧化应激响应中的调控机制提供了重要理论依据。

关键词： 小黄鱼   gfpt1基因   克隆   高温胁迫   变形假单胞菌  

摘要： 夏季频发的高温以及养殖过程中变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)引起的内脏白点病已成为制约小黄鱼(Larimichthys polyactis)养殖业发展不容忽视的问题。谷氨酰胺果糖-6-磷酸转氨酶-1(gfpt1)基因是信号转导和应激响应的关键调节因子。为探究gfpt1基因在小黄鱼对高温胁迫和变形假单胞菌感染过程中的响应特征,本研究首次克隆获得小黄鱼gfpt1基因的CDS序列,序列长度为2049 bp,编码682个氨基酸,含有PLN02981 super family保守结构域,同源序列比对发现,其与大黄鱼(Pseudosciaena crocea)相似性最高,达99.37%。荧光定量检测发现,gfpt1基因在各组织中广泛表达,但表达量具有组织差异性,肝脏中的表达量显著高于其他组织。通过荧光定量PCR技术检测32℃高温胁迫和变形假单胞菌感染不同时间小黄鱼肝脏中gfpt1表达水平变化发现,高温胁迫导致gfpt1表达量显著增加,随着高温处理时间的延长,基因表达量呈先升高后降低的变化趋势,6 h时的表达量最高;变形假单胞菌感染同样导致gfpt1表达量发生显著变化,感染后6 h的基因表达量显著低于对照组,随着感染时间的延长,表达量逐渐上升,48 h时达到最高,此时显著高于对照组,随后表达量逐渐降低,至96 h时,其表达量显著低于对照组,说明gfpt1在小黄鱼响应高温胁迫和病原菌侵染过程中发挥了一定的调节作用,但二者响应机制存在明显不同。本研究揭示了小黄鱼肝脏中gfpt1在响应高温胁迫和变形假单胞菌感染的表达变化特征,研究结果为深入解析鱼类响应高温胁迫、病原菌感染等过程中的生理调节机制奠定了重要基础。

关键词： 剑白香猪   大白猪   COL4A4基因   单核苷酸多态性  

摘要： 为比较大白猪与剑白香猪COL4A4基因的单核苷酸多态性(SNPs)差异,及其编码蛋白的理化性质与结构特征,试验以猪参考基因组(Sscrofa11.1)与剑白香猪基因组重测序数据对比筛选出潜在的差异SNPs位点,采用PCR扩增结合混池测序技术,对大白猪和剑白香猪的COL4A4基因SNPs位点进行验证,再利用生物信息学软件对二者COL4A4基因编码蛋白的理化性质与结构进行比较分析。结果:剑白香猪COL4A4基因外显子区域有4个有效SNPs位点:G.128492878 A>G和G.128550383 A>G为错义突变,均导致丝氨酸转变为脯氨酸;G.128492894 T>G和G.128492900 C>T为同义突变,突变前后氨基酸不变。大白猪COL4A4基因外显子区域未检出以上SNPs位点。生物信息学对比分析显示,两种猪的COL4A4蛋白均为亲水性胞外分泌蛋白,但剑白香猪COL4A4蛋白的基本理化特性与大白猪存在细微差异;在二级结构中,两者均以无规则卷曲占比最高,但α-螺旋和无规则卷曲的占比存在差异。结论:剑白香猪COL4A4基因存在4个特有SNPs位点,含2个导致丝氨酸→脯氨酸改变的错义突变,而大白猪未检出这些突变。COL4A4基因突变后编码蛋白的分子质量、脂肪系数增加;不稳定系数、磷酸化位点数减少;二级结构中α-螺旋增加,无规则卷曲相对减少。

关键词： N6-甲基腺苷   中医药   卵巢衰老   干细胞  

摘要： N6-甲基腺苷(m6A)在女性卵巢衰老中发挥重要作用,其异常表现可导致卵母细胞成熟障碍及颗粒细胞功能损伤,涉及线粒体功能障碍、端粒缩短、氧化应激损伤、衰老表型分泌、细胞凋亡、减数分裂异常及多种表观遗传信息改变等衰老相关环节。m6A及其调节因子与临床多种卵巢疾病密切相关,包括年龄相关卵巢功能减退、早发性卵巢功能不全(POI)及卵巢储备功能减退(DOR)。中药复方、褪黑素、干细胞等可影响m6A修饰改变,参与卵巢衰老的发生与发展。在生殖领域体系中,m6A修饰作为新兴研究方向,逐渐成为备受关注的热点,本文综述了m6A在卵巢衰老相关机制研究中的前沿发现及潜在临床治疗措施,以期为女性生育力下降提供新的诊断思路及治疗靶点。

关键词： 蛋白质   可食用膜   制备方法   果蔬保鲜   保鲜机理  

摘要： 该文对蛋白质基可食用膜主要制备方法(流延成膜法、浸涂法、静电纺丝法)以及膜性能评价方法进行系统综述,并重点综述明胶基可食用膜、大豆分离蛋白基可食用膜、玉米醇溶蛋白基可食用膜、乳清蛋白基可食用膜等常见蛋白基膜在不同果蔬保鲜中的应用前景,探讨其在果蔬保鲜中的膜层对气体与水分迁移的调控作用及功能性成分的增效机制,以期为蛋白质基可食用膜的研发方向奠定基础,为拓展其在果蔬采后保鲜领域的应用提供新思路。

关键词： 大口黑鲈(Micropterus salmoides)   IL-1β   IL-18   多克隆抗体   鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)  

摘要： 为了探究大口黑鲈(Micropterus salmoides)IL-1β和IL-18在鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)感染过程中的免疫应答反应,本研究制备了针对大口黑鲈IL-1β和IL-18的多克隆抗体,并检测感染鰤诺卡氏菌后大口黑鲈组织病变和二者的蛋白表达水平。实验首先分析大口黑鲈IL-1β和IL-18并选择合适的表达区段,构建pET-32a-Ms IL-1β和pET-32a-Ms IL-18重组质粒并以IPTG诱导蛋白表达,经纯化后获得分子大小约49 kDa和40 kDa的Ms IL-1β和Ms IL-18重组蛋白,分别免疫日本大耳兔和Balb/C小鼠,获得抗血清后确认其效价和特异性;随后以鰤诺卡氏菌感染大口黑鲈,以本研究制备的多克隆抗体检测到肝脏中IL-1β与IL-18蛋白水平显著增加,与肝脏病理分析中大量炎性细胞浸润结果一致。综上,本研究成功制备了大口黑鲈IL-1β与IL-18多克隆抗体,并揭示了其在鰤诺卡氏菌感染大口黑鲈后蛋白表达水平显著升高。

关键词： 肥厚型心肌病   CST7基因   微小核糖核酸-18a-3p   巨噬细胞   免疫调控  

摘要： 目的:筛选与肥厚型心肌病(HCM)相关的免疫调控关键基因,探究其与上游微小核糖核酸(miRNA,缩写为miR)之间的调控关系,并在动物模型中验证关键miRNA-基因轴的治疗潜力。方法:本研究使用的转录组数据包括基因表达数据库(GEO)中的GSE141910数据集(HCM患者心肌组织样本28例;健康对照者心肌组织样本166例)和GSE181764数据集(HCM患者心肌组织样本7例;健康对照者心肌组织样本2例),另采集4例HCM患者与3名健康志愿者外周血单核细胞(PBMC)自建PBMC转录组数据,识别差异表达的免疫相关基因。候选基因通过双样本孟德尔随机化(MR)分析评估其因果关联性;通过双荧光素酶实验预测并验证miRNA与信使核糖核酸(mRNA)之间的相互作用。另选8~12周龄C57BL/6J雄鼠24只,随机分为4组(每组6只):对照组(健康对照小鼠,无任何干预)、HCM组[通过主动脉弓缩窄(TAC)术构建HCM小鼠模型]、HCM+正常对照(NC)组[在TAC术后第7天行腺相关病毒(AAV)空载体病毒注射]、HCM+CST7组(在TAC术后第7天行AAV-CST7病毒注射),干预4~6周后取样分析,评估各组小鼠的心功能及组织病理改变。结果:通过分析多组学数据筛选出CST7关键免疫基因,其在HCM患者的心肌及外周血样本中均显著上调。双样本MR分析显示,CST7表达与HCM风险呈负相关(OR=0.8989,P=6.77×10^(-5))。免疫谱分析显示,CST7表达与活化CD8+T细胞显著相关。双荧光素酶实验证实,在HCM中显著上调的hsa-miR-18a-3p为CST7的直接转录后抑制因子,直接靶向并抑制其表达。在体内实验中,通过AAV载体在TAC诱导的HCM小鼠模型中过表达CST7,结果显示,此干预显著改善左心室射血分数和左心室缩短率等心功能指标,病理学分析也证实其能减小心肌细胞横截面积(缓解心肌细胞肥厚)并显著减少心肌间质纤维化。结论:在HCM中,miR-18a-3p-CST7免疫调控轴通过调节炎症重塑过程发挥保护效应。靶向该通路恢复CST7表达有望成为心肌病免疫治疗的新策略。

关键词： 牙龈卟啉单胞菌   脂多糖   mtDNA   cGAS   STING   焦亡  

摘要： 目的:探讨牙龈卟啉单胞菌(***)脂多糖(LPS)对人牙龈成纤维细胞(HGFs)焦亡的影响及可能的调控机制。方法:收集14例牙周炎患者和14例牙周健康者的牙龈组织样本,免疫组化染色检测焦亡相关分子消皮素D(GSDMD)、信号分子环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)及干扰素基因刺激蛋白(STING)的蛋白表达水平,并分析其与牙周临床指标的相关性。伴或不伴线粒体DNA(mtDNA)抑制剂溴化乙锭(ETBR)/STING抑制剂H151处理HGFs时,采用*** LPS和腺苷三磷酸(ATP)共同刺激HGFs,流式细胞术检测线粒体活性氧(mtROS)总量变化,实时荧光定量PCR检测胞质中mtDNA水平,Western blot检测cGAS/STING和炎症小体NOD样受体蛋白3(NLRP3)及焦亡相关蛋白表达水平;免疫荧光染色观察胞内NLRP3和含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)共定位水平,扫描电镜观察细胞焦亡形态,并评估乳酸脱氢酶(LDH)释放水平。结果:与牙周健康者相比,牙周炎患者的牙龈组织中GSDMD、cGAS和STING表达增高(P<0.01),且三者表达水平与牙龈指数(GI)、探诊深度(PD)、临床附着丧失(CAL)均呈正相关(P<0.001)。*** LPS+ATP刺激后,HGFs的mtROS水平升高,胞质mtDNA释放增加(P<0.001),cGAS、STING、NLRP3及焦亡相关蛋白表达水平升高(P<0.01),NLRP3和ASC共定位水平升高(P<0.001),同时导致HGFs细胞肿胀与变形,胞膜出现孔隙,LDH释放水平升高(P<0.001);而H151或ETBR预处理均能抑制上述改变(P<0.01)。结论:*** LPS可能通过促进mtDNA释放激活cGAS/STING信号通路,进而活化NLRP3炎性小体,最终诱导HGFs焦亡,参与调控牙周免疫炎症反应。

关键词： 支链氨基酸   白色脂肪组织   巨噬细胞   炎症反应   Setd2   H3K36me3  

摘要： 目的 支链氨基酸(branched-chain amino acids,BCAA)代谢紊乱与肥胖的发生及发展密切相关,白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)炎症反应是肥胖的重要标志,但BCAA与WAT炎症反应之间的关系尚不明确,本研究旨在探索BCAA对肥胖小鼠WAT炎症反应的影响及其下游机制。方法 将8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为3组,分别给予正常饮食(chow diet,CD)、高脂联合高BCAA饮食(high fat diet+BCAA,HFD+BCAA)以及与HFD+BCAA组小鼠每日摄取热量匹配的高脂饮食(HFD paired)饲喂。每周记录小鼠体质量,12周后进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。利用苏木素-伊红染色评估WAT形态。通过Bulk RNA测序检测WAT基因表达情况。使用F4/80,即含生长因子样模体黏液样激素样受体(EGF-like module-containing mucin-like hormone receptor-like 1,Emr1)免疫荧光染色评估WAT巨噬细胞的浸润程度。通过全局组蛋白修饰质谱分析检测BCAA对WAT组蛋白修饰的影响。使用Western blot检测BCAA对棕榈酸(palmitic acid,PA)孵育的小鼠原代巨噬细胞组蛋白H3赖氨酸36位点3甲基化(histone H3 trimethylation at lysine 36,H3K36me3)修饰水平及其甲基转移酶SET结构域包含蛋白2(SET domain containing 2,Setd2)蛋白表达。利用小干扰RNA沉默Setd2基因表达后,采用实时定量PCR评估BCAA对PA孵育的小鼠原代巨噬细胞炎症基因白介素-1b(interleukin-1b,IL1b)、白介素-6(interleukin-6,IL6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)表达。结果 与HFD paired组相比,HFD+BCAA组小鼠体质量没有明显改变,但WAT缩小,葡萄糖耐量和胰岛素耐量进一步受损(P<0.01)。Bulk RNA测序显示,与HFD paired组相比,HFD+BCAA组附睾WAT基因表达显著改变,表现为炎症通路显著上调。BCAA导致WAT中更多的巨噬细胞浸润和炎症因子表达水平升高(P<0.01)。与HFD paired组相比,HFD+BCAA组WAT中组蛋白H3K36me3修饰显著升高(P<0.01),并且主要发生在浸润的巨噬细胞中。在体外实验中,BCAA增加PA孵育巨噬细胞H3K36me3修饰水平(P<0.01),上调其甲基转移酶Setd2及其炎症基因表达(P<0.01),而沉默Setd2表达可以逆转BCAA对巨噬细胞炎症反应的促进作用(P<0.01)。结论 BCAA通过Setd2-H3K36me3途径增加巨噬细胞炎症基因表达,从而促进肥胖小鼠WAT炎症反应和胰岛素抵抗。

关键词： 腐败梭菌   α毒素   单克隆抗体   竞争ELISA  

摘要： 为方便临床上检测腐败梭菌血清样本,以及评价腐败梭菌疫苗对动物的免疫效果,本试验利用大肠杆菌表达系统诱导α毒素重组蛋白的表达,经纯化后免疫BALB/c小鼠,制备α毒素单克隆抗体。以筛选的单抗为捕获抗体,通过棋盘滴定法优化反应条件,建立腐败梭菌α毒素抗体的竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法,利用该方法检测绵羊血清样本的阴阳性临界值,并评估其重复性、灵敏度、特异性和符合率,同时检测牛血清样本的阴阳性临界值。结果显示,成功诱导表达和纯化出约65 kDa的目的蛋白;通过杂交瘤技术筛选获得1株稳定分泌特异性抗体的单抗8H2;竞争ELISA最佳抗原包被条件为300 ng/孔、16 h,血清稀释度为1∶1,单抗稀释度为1∶2000,封闭条件为1%牛血清白蛋白(BSA)、90 min,血清和单抗竞争时间为90 min,二抗稀释度为1∶15000、孵育30 min,显色时间为15 min;该方法检测绵羊血清样本的阳性临界值为27.19%,阴性临界值为22.59%;批间和批内变异系数均低于10%,重复性良好;标准阳性血清稀释度为1∶16时仍为阳性;与产气荚膜梭菌、布鲁氏菌和鼠伤寒沙门菌均无交叉反应,特异性良好;利用该方法检测100份绵羊血清样本,与间接ELISA的检测总符合率为89.00%(89/100);检测牛血清样本的阳性临界值为20.00%,阴性临界值为16.30%。本试验成功制备了1株腐败梭菌α毒素特异性单抗,并构建了抗体竞争ELISA检测方法,为腐败梭菌病的早期诊断和疫苗免疫效果评价提供了技术支撑。