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关键词： AlphaFold   蛋白质结构预测   结构动力学   相互作用预测  

摘要： 以AlphaFold为代表的人工智能方法,已在蛋白质结构高精度预测方面取得革命性进展,对合成生物学、药物研发、生物材料设计及生命科学等前沿领域产生了深远影响。系统梳理了蛋白质结构预测领域的方法进展,并重点聚焦于AlphaFold的技术演进路径。通过深入的技术分析,揭示了其在数据依赖性、非天然状态构象推断、动态构象转变、复合物相互作用预测以及环境响应等方面的局限性。在此基础上,明确了当前蛋白质结构预测领域面临的关键挑战,并针对现有方法的不足,提出了可能的应对策略。最后,展望了蛋白质结构预测研究的未来发展方向,旨在为后续方法改进与应用拓展提供理论依据与实践参考。

关键词： 靶向PCSK9单克隆抗体药物   生物分析   PCSK9标志物   免疫原性  

摘要： 前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)抑制剂是一类新型降脂药物,该类药物的发现改变了以往血脂异常的治疗方式,其突破不仅在于长时间维持低密度脂蛋白胆固醇水平降低的状态,更在于显著降低主要心血管事件的风险。靶向PCSK9单克隆抗体药物药动学和药效学的准确表征高度依赖于准确的生物分析方法,设计合理且验证充分的生物分析方法可为其临床研发项目中的科学决策提供坚实的数据基础。本文围绕靶向PCSK9单克隆抗体药物生物分析的3大核心维度,即血药浓度分析、PCSK9标志物分析及抗药抗体分析,系统梳理其检测原理、方法差异、关键问题及优化策略,旨在为同类药物生物分析方案设计、方法学验证及临床药理学评价提供参考,并为该类药物的临床研发提供借鉴。

关键词： SDF-1α   微球   缓释   牙髓再生   人牙髓干细胞  

摘要： 目的探究负载基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha,SDF-1α)的同轴静电喷雾微球对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)迁移与分化的作用。方法采用静电喷雾法制备SDF-1α/PLGA微球,扫描电镜(phosphate buffer solution,SEM)与透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察形貌与结构,ImageJ软件分析粒径,ELISA测定包封率及体外释放实验。CCK-8检测微球对hDPSCs增殖的影响,Transwell实验评估微球促进细胞迁移的能力,实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,RT-qPCR)检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、牙本质基质蛋白-1(dentin matrix protein-1,DMP-1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)、血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)等基因的表达情况。结果SDF-1α/PLGA微球均匀分散,呈核壳结构,平均粒径约(0.79±0.13)μm,包封率为(73.8±0.30)%。微球在24 h内出现初始突释,随后释放逐渐平缓,30 d累计释放达71.04%。SDF-1α/PLGA微球在第1天微球组与对照组OD值分别为(0.45±0.04)和(0.43±0.04),差异无统计学意义(P>0.05);第3天微球组显著高于对照组,分别为(1.25±0.06)和(0.89±0.05)(P<0.05);第5天微球组OD值为(1.69±0.08),显著高于对照组的(1.38±0.06)(P<0.05)。第4周微球缓释液诱导的迁移细胞数量为(106±9)个/视野,与对照组的33±7个/视野相比,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,微球组的ALP、DMP-1、DSPP、Ang-1、CD31相对表达量分别提高了2.06倍、1.81倍、1.80倍、2.12倍、2.00倍,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论负载SDF-1α的同轴静电喷雾微球可有效促进hDPSCs迁移和成牙本质及成血管向分化。

关键词： 食用菌多糖   提取   纯化   生物活性  

摘要： 目前对于食用菌多糖的提取方法有很多,但是提取率普遍较低,因此,综述了食用菌多糖的多种提取、纯化方法,对其生物活性进行了归纳与总结,旨在为后续食用菌多糖的进一步深化研究提供参考。

关键词： 新生大鼠   人脐带间充质干细胞   胆红素脑病   水通道蛋白4   炎症因子   治疗  

摘要： 目的建立大鼠胆红素脑病(bilirubin encephalopathy,BE)模型并探讨人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,hUC-MSCs)移植对新生大鼠BE的干预作用。方法选择123只3日龄(记为D3)SD大鼠,48只进行预实验,随机分为T0(生理盐水)、T1(胆红素溶液50μg/g)、T2(胆红素溶液100μg/g)、T3(胆红素溶液150μg/g)组,连续3 d腹腔注射进行造模,评估造模效果,选出最佳造模剂量。75只进行正式实验,随机分为Control(对照)组、BE组、hUC-MSCs组,BE组与hUC-MSCs组腹腔注射胆红素(最佳造模剂量×3次,1次/d),Control组注射生理盐水;在第1次腹腔注射后,hUC-MSCs组侧脑室注射人脐带间充质干细胞(1×10^(6)/5μl),其余组注射磷酸盐缓冲液。采用苏木精-伊红染色观察脑组织,Western blot检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,INOs)、水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)表达,Morris水迷宫评估空间学习记忆能力。结果预实验结果显示,建立稳定新生大鼠BE模型腹腔注射胆红素溶液的最佳剂量为100μg/g×3次、1次/d。正式实验结果显示,BE组与hUC-MSCs组大鼠在D3~D10均出现皮肤黄染、少动、嗜睡等异常表现;D10后,BE组大鼠开始出现易激惹,而hUC-MSCs组行为更接近Control组;体重监测显示,BE组自D17起体重显著低于hUC-MSCs组(P<0.001)及Control组(P=0.009),至D31差异进一步扩大(P均<0.001);苏木精-伊红染色显示,D6和D10时,hUC-MSCs组海马区神经元损伤较BE组减轻;D6时,hUC-MSCs组脑组织AQP4、TNF-α、INOs表达低于BE组(P<0.05);Morris水迷宫结果显示,训练第3~6天,hUC-MSCs组逃避潜伏期短于BE组(P<0.05),空间探索中穿越平台次数多于BE组(P<0.001)。结论成功建立新生大鼠BE模型腹腔注射胆红素溶液的最佳造模剂量为100μg/g×3次、1次/d。hUC-MSCs可能通过减轻炎症反应及细胞毒性水肿,减轻神经细胞损伤并促进大鼠远期学习、空间记忆能力的恢复。

关键词： 不确定度评定   猪圆环病毒2型   核酸检测   荧光PCR   影响因素  

摘要： 通过实验室猪圆环病毒2型核酸检测(荧光PCR)不确定度评定。为动物检疫CNAS实验室的荧光PCR检测方法提供一种不确定评定的方法,识别出对检测结果的主要和次要检测要素不确定度的影响,从而提高实验室检测结果的准确性。按照JJF1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》分析和评定检测结果,以样品不同时间重复检测为A类不确定度,以加样时所用移液器的体积、核酸提取试剂、PCR仪的温度、环境温度、标准物质等引入的因素为B类不确定度。结果显示,A类不确定度为0.07,B类不确定度为0.50,合成不确定度为0.51,扩展不确定度为1.02(k=2)。结果表明,重复检测的A类不确定度、B类不确定中核酸提取试剂和荧光PCR仪(标准物质)的不确定度占主要因素。

关键词： 枸杞多糖   沙棘多糖   树莓多糖   白刺多糖   抗氧化   降糖   活性   物理   性能  

摘要： 目的定量评估从枸杞(Lycium barbarum L.)、沙棘(Hippophae rhamnoides L.)、白刺(Nitraria tangutorum Bobrov)和树莓(Rubus idaeus L.)浆果中提取的多糖的体外抗氧化性能、降糖活性及其物理性能。方法通过测定2,2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)清除能力、总还原力,α-淀粉酶抑制率及α-葡萄糖苷酶抑制率的指标,系统评估枸杞、沙棘、白刺、树莓多糖的抗氧化性能与降糖活性;测定水溶性、膨胀性、持水性、持油性及保湿性等物理性能;构建抗氧化活性、降糖活性及物理性能相关指标的热图,并开展相关性分析。结果当质量浓度为4 mg/mL时,沙棘、树莓、枸杞、白刺多糖ABTS自由基清除率的IC50分别为0.609、1.087、1.791、2.899 mg/mL。在测定范围(1 mg/mL~4 mg/mL)内,枸杞、沙棘、白刺、树莓浆果多糖存在良好的量效关系。枸杞、沙棘、树莓、白刺多糖DPPH自由基清除率的IC50分别为0.8432、0.9480、0.6495、1.709 mg/mL。在700 nm处测得的质量浓度为5 mg/mL的枸杞、沙棘、树莓、白刺多糖溶液的总还原力值依次为1.44、1.32、1.29、0.85。当树莓、枸杞、沙棘、白刺多糖的质量浓度达到1 mg/mL时,它们对α-淀粉酶的抑制率分别是61.64%、58.16%、52.44%、48.31%。当枸杞、沙棘、白刺、树莓多糖的质量浓度达到1 mg/mL时,枸杞、沙棘、树莓、白刺多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率分别是48.46%、43.15%、41.29%、38.94%。所测物理性能显示,枸杞多糖的水溶性最高(90.33%),其后依次是树莓多糖(88.33%)、沙棘多糖(87.67%)、白刺多糖(87.00%);沙棘多糖的膨胀性最高(23.83%),其后依次是枸杞多糖(20.67%)、树莓多糖(19.43%)、白刺多糖(15.67%);枸杞多糖持水性最高(13.91%),其后依次是树莓多糖(11.25%)、白刺多糖(10.48%)、沙棘多糖(9.86%);枸杞多糖持油性最高(9.00 g/mL),其后依次是树莓多糖(8.76 g/mL)、沙棘多糖(7.06 g/mL)、白刺多糖(6.90 g/mL);枸杞多糖的保湿性最优,其后依次是沙棘多糖、树莓多糖、白刺多糖。综合分析显示,枸杞多糖在α-淀粉酶抑制率、α-葡萄糖苷酶抑制率、保湿性、持油性、水溶性、总还原力和DPPH自由基清除能力以及多糖含量方面表现良好;沙棘多糖在多糖含量和ABTS自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及总还原力、膨胀性方面表现良好;树莓多糖在α-淀粉酶抑制率、持油性和DPPH自由基清除能力方面表现良好。结论在枸杞、沙棘、白刺、树莓多糖中,枸杞多糖在体外抗氧化能力、降糖活性及物理性能方面表现良好。

关键词： 叶酸   小鼠胚胎干细胞   分化   神经管畸形  

摘要： 小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)凭借其多向分化潜能和自我更新特性,已成为解析哺乳类胚胎发育机制的理想模型。叶酸作为一碳代谢的核心辅酶,其缺乏导致的神经管缺陷(neural tube defects,NTDs)已成为全球性公共卫生问题[1],但其致病机制不明。叶酸是否会通过影响小鼠胚胎干细胞向神经谱系分化进而参与NTDs疾病的发生尚不明确。本研究通过构建叶酸缺乏mESCs向神经谱系分化模型,系统解析叶酸在神经谱系定向分化中的作用及其与神经管畸形发生的潜在关联。研究结果显示,在mESC向神经谱系分化过程中,叶酸缺乏mESCs诱导的拟胚体直径显著小于正常叶酸对照组(P<0.05);通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)及免疫荧光检测神经前体细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达水平,结果显示,相较于正常叶酸对照组,叶酸缺乏组巢蛋白的mRNA水平和蛋白质水平均下降(P<0.05)。此外,免疫荧光染色也显示Ki67荧光水平在叶酸缺乏组明显下降(P<0.05),提示叶酸缺乏诱导分化的神经前体细胞增殖能力受损。同时,在神经分化过程中的关键时间节点第4 d(day 4,D4)、第8 d(day 8,D8)分别对其进行转录物组测序。分别对比对照组和叶酸缺乏组在D4和D8的差异表达基因(differentially expressed gene,DEGs)进行GO功能富集,结果提示,叶酸缺乏导致中胚层分化偏倚,提示叶酸缺失可能通过破坏胚层命运决定导致神经分化异常。比较D4和D8的对照组和叶酸缺乏组DEGs,KEGG通路分析进一步揭示PI3K-AKT、MAPK及Wnt信号通路在叶酸缺乏组显著富集。Western印迹检测PI3K、AKT及其磷酸化蛋白质水平在叶酸缺乏组的D8显著升高,使用PI3K抑制剂可使叶酸缺乏组Nestin、Pax6、Otx2表达水平显著升高(P<0.05),可挽救叶酸缺乏导致的外胚层分化下降现象。综上,本研究通过构建叶酸缺乏小鼠胚胎干细胞分化模型,揭示叶酸在神经谱系命运决定过程中的作用,阐明叶酸缺乏导致的谱系命运决定异常可能是NTDs发生的原因之一。本文的研究为阐释叶酸缺乏导致神经管畸形的致病机制提供新视角,也为相似发育缺陷的致病机制研究提供新的理论依据。

关键词： 猫冠状病毒   纤突蛋白   B细胞抗原表位   串联表达   原核表达   多克隆抗体  

摘要： 根据纤突(S)蛋白的氨基酸序列以及病毒中和抗体反应差异,可将猫冠状病毒(FCoV)分为血清I型病毒(FCoV-I)和II型病毒(FCoV-II),其中FCoV-I是猫特异性毒株,在全球范围内广泛流行。FCoV S蛋白中S1亚基包含病毒主要抗原表位,但由于天然S1区域存在糖基化修饰复杂、表达稳定性差等问题,制约了S蛋白的抗体开发。为高效制备FCoV-I S蛋白特异性抗体,采用生物信息学软件分析FCoV-I基因组的共有序列,从FCoV-I S1蛋白筛选出11个线性B细胞抗原表位区域,通过柔性linker串联,获得重组蛋白RM504的氨基酸序列;经优化密码子和合成核苷酸序列,成功构建重组蛋白RM504原核表达载体pET28a-RM504。通过IPTG诱导4 h,表达出约55 kDa的重组蛋白His-RM504,经镍柱纯化后,将重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果显示,制备的S1蛋白多克隆抗体ELISA效价最高可达1:320000。本研究成功获得了FCoV-I S1多表位串联重组蛋白及小鼠多克隆抗体,为后续FCoV-I感染的临床诊断方法开发和多表位疫苗设计奠定了基础。

关键词： 当归多糖片段   酸剪切   响应面法   抗氧化   美白   吸湿   保湿   中药现代化技术  

摘要： 采用单因素和响应面实验优化了当归多糖(APS)的酸剪切工艺,经柱层析法对酸剪切后的当归多糖分子片段混合物进行分离纯化,得到当归多糖片段。利用UV-Vis、FTIR、HPGPC、HPLC、SEM和TGA对当归多糖片段进行了表征。考察了当归多糖片段对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐阳离子(ABTS^(+))自由基、超氧基自由基(•O_(2)^(-))和羟基自由基(•OH)的清除率,通过酪氨酸酶清除实验考察了当归多糖片段的美白活性,在不同相对湿度下考察了当归多糖片段的吸湿和保湿活性。结果表明,在剪切试剂HCl浓度0.15 mol/L、时间1.5 h、温度80℃的条件下,当归多糖酸剪切片段的总抗氧化活性最高,为29.87%±0.30%;纯化后得到4种不同相对分子质量(简称分子量)的当归多糖酸剪切片段(ASP-1a~ASP-4a),均具有一定的抗氧化、美白、吸湿、保湿活性,其中,ASP-1a是由物质的量比为550∶3.49∶3.18的葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)和鼠李糖(Rha)组成,是唯一含有Rha的多糖,重均分子量为19014,30~200℃的质量损失率为7.87%,其对DPPH•、ABTS^(+)•、•O_(2)^(-)和•OH的半数抑制质量浓度(IC50)分别为679.86、381.18、644.87、906.55μg/mL,对酪氨酸酶单酚酶、二酚酶的IC50分别为6.78、10.97 g/L。在20℃、相对湿度43%的环境中,吸湿率和保湿率分别>107.00%、>99.40%,在20℃、相对湿度83%的环境中,吸湿率和保湿率分别>143.00%、>99.80%,综合抗氧化、美白、吸湿和保湿功效最优。