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关键词： 红肉火龙果   果糖激酶   基因克隆   蛋白表达   酶活  

摘要： 植物果糖激酶(fructokinase,FRK)特异性催化果糖磷酸化进入糖酵解途径,是果糖代谢和可溶性糖积累的关键酶。阐明红肉火龙果果实HpFRK2基因的表达模式及酶特性,为了解果实可溶性糖积累的分子机制并改良果实品质提供理论基础。本研究从红肉火龙果紫红龙品种中克隆HpFRK2基因,采用实时荧光定量PCR分析该基因表达模式,采用烟草叶肉细胞瞬时表达检测其亚细胞定位,通过原核表达获得重组蛋白并检测其酶活性。结果表明:HpFRK2基因的开放阅读框(open reading frame,ORF)为1026bp,编码341个氨基酸。HpFRK2蛋白相对分子质量为36.95kDa,理论等电点为5.94。系统进化分析表明HpFRK2与木薯MeFRK2、番茄SlFRK1、苹果MdFRK1和拟南芥AtFRK1具有较近的亲缘关系。蛋白序列分析表明其含有磷酸果糖激酶B(phosphofructokinase type B,pfkB)家族保守结构域。HpFRK2在果实发育20d时的表达量最高,随着果实发育逐渐降低表达,30d时表达量最低;此外,HpFRK2在茎中的表达显著低于果实。亚细胞定位检测表明HpFRK2主要位于细胞质。构建原核表达载体在大肠杆菌表达,成功诱导获得HpFRK2重组蛋白。酶活性检测表明HpFRK2特异性催化果糖磷酸化,果糖对酶活性不具有底物抑制性,催化果糖磷酸化的Km值为1.84mmol/L。本研究结果表明,红肉火龙果HpFRK2蛋白位于细胞质,特异催化果糖磷酸化,主要在果实转色期(花后20~23 d)表达,可能负调控果实的果糖积累。

关键词： 静电纺丝   壳聚糖   氧化灵芝多糖   伤口敷料  

摘要： 为促进糖尿病慢性伤口快速愈合,构建具有清除活性氧、抗炎及抑菌功能的壳聚糖(CS)/明胶(Gel)/氧化灵芝多糖纳米纤维膜,本文通过单因素方法筛选适宜的基质浓度、壳聚糖/明胶/氧化灵芝多糖比例,观察纳米纤维膜微观形貌,并用差示热分析法测定热力学性能、重量法测定纳米纤维膜的吸水性和透气性、水接触角方法测定纤维膜的亲水性。然后,采用静电纺丝技术成功构建了壳聚糖/明胶/氧化灵芝多糖纳米纤维膜,且Gel浓度为12%,氧化灵芝多糖含量为0.05 g, CS/Gel=1∶6,纳米纤维膜纤维平滑整齐,平均直径在718 nm左右,机械性、吸水性良好,透气性在130~135 g/m2/h,水接触角小于90°。结果表明:本实验构建的纳米纤维膜具有作为伤口敷料的潜质,为后续其促伤口愈合研究奠定了基础。

关键词： 维生素A   肉鸡   生长性能   氨基酸   脂肪酸  

摘要： 文章旨在探究维生素A对肉仔鸡生长性能、肌肉氨基酸和脂肪酸组成的影响。试验将540羽健康的1日龄AA肉鸡随机分为4组,每组9个重复,每个重复15羽,分别添加0、2500、5000、7500 IU/kg的维生素A作为试验日粮,试验为期41 d。结果表明,与对照组相比,添加7500 IU/kg的维生素A组仔鸡末重显著提高4.84%(P<0.05),日增重显著提高4.91%(P<0.05),添加5000和7500 IU/kg维生素A组料重比分别显著降低3.01%和4.89%(P<0.05),添加0~7500 IU/kg维生素A对仔鸡初重及采食量影响不显著(P>0.05)。7500 IU/kg的维生素A组肌肉赖氨酸、精氨酸含量显著提高(P<0.05),2500~7500 IU/kg维生素A组谷氨酸、甘氨酸含量显著提高(P<0.05),亮氨酸含量显著降低(P<0.05),5000和7500 IU/kg的维生素A组丙氨酸、胱氨酸含量显著提高(P<0.05),组氨酸含量显著提高(P<0.05)。5000和7500 IU/kg维生素A组C16:1、C18:3n-3、C22:6n-3和多不饱和脂肪酸含量显著提高(P<0.05),C18:1n-9含量显著降低(P<0.05),7500 IU/kg维生素A组C20:2含量显著提高(P<0.05),2500~7500 IU/kg维生素A组C20:3n-6含量显著提高(P<0.05)。结论:添加维生素A(7500 IU/kg)能提高肉仔鸡生长性能,改善肌肉氨基酸、脂肪酸组成。

关键词： 黑木耳菌糠   多糖   正交试验   表征   抗氧化   降血糖  

摘要： 本实验以黑木耳菌糠为原料,在单因素实验基础上,采用正交试验法优化黑木耳菌糠多糖(Polysaccharides from Spent Auricularia auricula Substrate,PSASs)提取条件。利用紫外光谱、红外光谱、离子色谱、刚果红实验对优化条件下的PSASs进行表征与测试。采用自由基清除实验和α-葡萄糖苷酶活性抑制实验评价其体外抗氧化和降血糖性能。结果表明:PSASs最佳提取条件为浸提时间1.5 h、液料比35:1 mL/g、提取温度85℃、提取4次,该条件下PSASs得率为(3.361±0.033)%。表征结果显示:PSASs由岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸组成,是一种具有三螺旋构象的β-吡喃糖。体外活性实验结果表明,PSASs对DPPH·、ABTS+·、OH·清除能力与浓度呈明显量效关系,其IC_(50)值分别为0.071、0.073、0.97 mg/mL;对α-葡萄糖苷酶活性有一定的抑制作用,抑制IC_(50)值为6.81 mg/mL。结论证实,PSASs具有体外抗氧化性能和降血糖作用。

关键词： 桑葚多糖   复合酶法   提取工艺   结构表征   生物有效性  

摘要： 为优化复合酶解法桑葚多糖提取工艺条件,采用复合酶(纤维素酶、果胶酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶)法提取桑葚多糖,运用单因素和正交试验优化其提取工艺条件;采用红外光谱、扫描电子显微镜(SEM)等对桑葚多糖进行结构表征,建立体外消化模型模拟桑葚多糖的体外消化过程探究其生物有效性。结果表明,桑葚多糖的最佳复合酶提取工艺条件为:纤维素酶、果胶酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶添加量分别为2.0%、2.0%、1.4%、0.2%;料液比1∶80(g∶mL),酶解pH值5,酶解时间20 min,酶解温度50℃。在此最佳工艺条件下,桑葚多糖得率达65.64%。结构表征表明,桑葚多糖分子质量为250139 kDa,主要由葡萄糖(26.25%)和半乳糖(25.20%)构成。桑葚多糖不具备晶体结构,形态结构为层状和孔隙结构。生物有效性分析结果表明,复合酶解法制备桑葚多糖生物利用度(37.69%)优于单一酶提取法(25.32%)和热水浸提法(17.53%)。

关键词： 牙髓干细胞   增殖   炎症因子   miR-410   脂多糖  

摘要： 目的:探究miR-410调节NF-κB信号通路对脂多糖(LPS)刺激的牙髓干细胞增殖能力及炎症因子分泌的影响。方法:采用qRT-PCR检测LPS刺激不同时间(0、12、24、48 h)牙髓干细胞中miR-410表达变化。将牙髓干细胞分为对照(Con)组、LPS组(10 ng/mL LPS处理48 h)、LPS+miR-NC组(转染miR-NC后经LPS处理48 h)、LPS+miR-410 mimics组(转染miR-410后经LPS处理48 h)、LPS+miR-410 mimics+PMA组(转染miR-410后经PMA和LPS处理48 h)。通过qRT-PCR检测miR-410表达,MTT实验检测细胞增殖能力,ELISA检测炎症因子白细胞介素(IL)-6、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平,蛋白免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白CyclinD1及NF-κB信号通路相关蛋白p-p65 NF-κB、p-IκBα表达。结果:随着LPS处理时间延长,牙髓干细胞中miR-410表达水平逐渐下降(P<0.01)。与Con组相比,LPS组牙髓干细胞中miR-410表达水平、细胞存活率、CyclinD1蛋白表达水平均降低,IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高,p-p65 NF-κB、p-IκBα蛋白表达水平均升高(P<0.05)。与LPS+miR-NC组相比,LPS+miR-410 mimics组牙髓干细胞中miR-410表达水平、细胞存活率、CyclinD1蛋白表达水平均增加,IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低,p-p65 NF-κB、p-IκBα蛋白表达水平均降低(P<0.05)。与LPS+miR-410 mimics组相比,LPS+miR-410 mimics+PMA组牙髓干细胞存活率、CyclinD1蛋白表达水平均明显降低,IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显升高(P<0.01)。结论:过表达miR-410可通过抑制NF-κB信号通路促进LPS刺激的牙髓干细胞增殖能力,抑制炎症因子分泌。

关键词： 生物小角X射线散射   蛋白质科学研究(上海)设施   同步辐射装置   BL19U2线站   蛋白质动态结构   整合结构生物学  

摘要： 同步辐射小角散射技术具有高通量、快速结构表征的特点,是溶液体系多尺度结构表征的研究利器,在蛋白质科学领域已得到广泛应用。位于上海同步辐射光源的BL19U2生物小角X射线散射线站(BioSAXS),可以在1~100纳米空间尺度以及毫秒时间尺度对生物大分子溶液活性结构进行表征。开放十年以来,BioSAXS线站与国家蛋白质科学研究(上海)设施其他技术系统协同发展,围绕蛋白质领域关键科学问题,有针对性地进行原位实验装置与散射实验算法开发,显著提升了线站散射数据采集的效率和精度,为理解蛋白质在溶液中的动态结构及其功能机制提供了新的视角。本文介绍了全球BioSAXS技术的发展现状以及技术演进。结合该技术在蛋白质科学研究中的典型应用案例,该文展望了BioSAXS技术与人工智能以及其他结构生物学方法融合在蛋白质科学研究中的应用前景。

关键词： 核酸分子检测技术   PCR技术   食品药品检测   沙门氏菌   大肠埃希菌  

摘要： 本研究筛选两对针对沙门氏菌和大肠埃希菌的特异性引物,进一步优化反应体系,建立双重实时荧光定量PCR方法,同时对两种细菌进行扩增和检测,提高检测效率。研究表明,建立的双重实时荧光定量PCR技术,为动物源性食品和药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌的快速测定提供了一种新的有效手段。

关键词： 湿地病毒   Gc抗原   单克隆抗体   噬菌体展示技术   免疫库  

摘要： 目的运用抗体是治疗病毒感染的重要措施,本研究针对正内罗病毒属湿地病毒表面Gc糖蛋白筛选制备特异性单克隆中和抗体。方法通过构建湿地病毒表面糖蛋白Gc重组表达载体,Gc抗原免疫小鼠后提取脾脏总RNA,构建鼠源抗原结合片段(fragment antigen binding,Fab)抗体库。通过噬菌体展示技术筛选针对抗原Gc的Fab抗体。筛选成功后,对筛选出的Fab抗体选择人源1型免疫球蛋白G(hIgG1)重链亚型进行抗体全长构建,并通过双质粒转染系统在Expi CHO细胞中进行表达。通过酶联免疫吸附试验检测抗体与Gc抗原的结合活性,并利用免疫空斑试验对抗体的有效性进行初步评估。结果构建了库容量为3.33×10^(8)cfu的Fab噬菌体抗体库,筛选出两株抗体A1、A2且抗体重链存在N-糖基化修饰。结合和中和活性检测结果显示A1、A2抗体的半数有效浓度(EC_(50))分别为0.728 nmol·L^(-1)与0.034 nmol·L^(-1),均具有一定的中和活性,可抑制病毒对细胞的杀伤。A2抗体在结合能力、中和能力方面均优于A1抗体。结论本研究成功制备了湿地病毒Gc糖蛋白的特异性单克隆抗体,为探究湿地病毒的防治方法奠定了基础并提供科学依据。

关键词： 左归丸   卵巢衰老   Nrf2/HO-1信号通路   氧化应激   卵巢生殖干细胞   细胞干性   大鼠  

摘要： 目的基于核因子红细胞2相关因子2(Nrf2)/血红素氧合酶1(HO-1)通路探讨左归丸改善环磷酰胺(CTX)诱导的卵巢衰老大鼠氧化应激及卵巢生殖干细胞(OSCs)干性的机制。方法将8周龄雌性SD大鼠随机分为正常组、模型组、戊酸雌二醇(EV)组(0.103 mg·kg^(-1))及左归丸低、高剂量组(1.850、3.702 g·kg^(-1)),每组6只。采用首日大鼠腹腔注射环磷酰胺50 mg·kg^(-1),第2~15天连续每日腹腔注射环磷酰胺5 mg·kg^(-1),复制卵巢衰老大鼠模型。模型复制结束后各组灌胃给药,每日1次,持续30 d。测定各组大鼠的体质量、卵巢湿质量,计算卵巢指数;监测大鼠动情周期,计算动情期紊乱率;采用HE染色法观察卵巢组织病理变化及各级卵泡计数;ELISA法检测血清抗缪勒管激素(AMH)、雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)水平;检测卵巢组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;采用Western Blot、RT-qPCR法检测卵巢组织中Nrf2/HO-1信号通路、细胞周期蛋白及OSCs细胞干性因子相关蛋白及基因的表达;免疫荧光法检测卵巢组织中OSCs干细胞标志物(Fragilis、MVH)的表达水平。结果(1)与正常组比较,模型组大鼠的体质量、卵巢指数均显著降低(P<0.001),动情期紊乱率显著升高(P<0.001);原始卵泡、窦前卵泡、窦状卵泡、黄体数量显著减少(P<0.01,P<0.001),闭锁卵泡数量显著增多(P<0.01);血清E2、AMH水平显著降低(P<0.001),FSH水平显著升高(P<0.001);卵巢组织MDA水平显著升高(P<0.01),SOD、GSH-Px活性显著降低(P<0.05,P<0.001);卵巢组织Nrf2、HO-1、NQO1、Cyclin D1、Cyclin E1、MVH、Oct4蛋白表达均显著下调(P<0.05,P<0.01,P<0.001),p21蛋白表达显著上调(P<0.01);卵巢组织Nrf2、HO-1、NQO1、Cyclin D1、Cyclin E1、MVH、Oct4 mRNA表达均下调,但差异无统计学意义(P>0.05),p21 mRNA表达显著上调(P<0.001);卵巢组织Fragilis、MVH荧光强度均显著下降(P<0.05,P<0.01)。(2)与模型组比较,各给药组大鼠的体质量均明显增加(P<0.05,P<0.01),动情期紊乱率均显著降低(P<0.01,P<0.001);血清FSH水平均明显降低(P<0.05,P<0.01);卵巢组织SOD活性显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.001),HO-1、Oct4蛋白表达显著上调(P<0.05,P<0.01),p21蛋白表达显著下调(P<0.05,P<0.01),Nrf2、Oct4 mRNA表达均显著上调(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。戊酸雌二醇组及左归丸低剂量组大鼠的卵巢指数明显升高(P<0.05,P<0.01),原始卵泡数量显著增加(P<0.01,P<0.001);血清E2水平明显升高(P<0.05);卵巢组织GSH-Px活性显著升高(P<0.05,P<0.01),Nrf2、MVH蛋白表达明显上调(P<0.05),NQO1、Cyclin D1 mRNA表达显著上调(P<0.05,P<0.01),p21 mRNA水平显著下调(P<0.01,P<0.001)。戊酸雌二醇组及左归丸高剂量组大鼠的窦状卵泡数量明显增加(P<0.05),闭锁卵泡数量明显减少(P<0.05);卵巢组织Cyclin D1蛋白表达明显上调(P<0.05),HO-1、MVH mRNA表达显著上调(P<0.05,P<0.01,P<0.001),Fragilis、MVH荧光强度均显著升高(P<0.05,P<0.01)。左归丸高剂量组大鼠卵巢组织Cyclin E1蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论左归丸可能通过Nrf2/HO-1通路缓解CTX诱导卵巢衰老大鼠的氧化应激损伤,调节OSCs细胞周期,维持OSCs细胞干性,从而恢复卵巢功能,延缓衰老进程。