课程文献中心 更多>>

关键词： 牛疱疹病毒1型   3'修复外切核酸酶1   MDBK   HEK-293T   3'→5'外切核酸酶  

摘要： 3'修复外切核酸酶1(TREX1)是哺乳动物中最丰富的3'→5'外切核酸酶,其功能缺陷或突变与多种自身免疫性疾病和炎症性疾病密切相关,但在病毒感染方面的作用研究较少。本课题组前期研究发现感染牛疱疹病毒1型(BHV-1)的牛肾细胞(MDBK)中TREX1表达显著增加。为探究TREX1在BHV-1感染MDBK细胞中的作用,利用携带牛TREX1基因的重组慢病毒,以感染复数(MOI)为2、4、6、8、10和60、120、180、240、300分别感染HEK-293T与MDBK,通过荧光显微镜观察筛选最适MOI,并建立稳定表达牛TREX1的传代细胞系。通过Western blot验证TREX1在细胞中的表达情况,并采用抗Flag亲和纯化法对TREX1进行纯化。将纯化的TREX1与化学合成的BHV-1末端双链DNA共同孵育,以检测其3'→5'外切核酸酶活性。结果显示,成功筛选出重组慢病毒感染MDBK和HEK-293T的最适MOI分别为240和8;利用Western blot在约38 kDa处检测到特异性条带,证实TREX1在细胞中稳定表达,并成功纯化出TREX1。体外酶活性试验证实,该纯化蛋白能够有效降解BHV-1 DNA,证实了体外表达的TREX1具有降解BHV-1 DNA的3'→5'外切核酸酶活性,为后续研究TREX1对BHV-1复制的调控作用奠定了基础。

关键词： 发酵豆粕   米曲霉   纳豆芽孢杆菌   蛋白酶   小肽  

摘要： 为提高豆粕粗蛋白质和小肽含量,本试验以豆粕为原料,对发酵菌株和蛋白酶种类进行筛选,通过单因素试验研究菌酶接种量、发酵和酶解条件对粗蛋白质和小肽含量的影响,然后通过正交试验设计确定菌酶协同发酵豆粕的最佳工艺条件。结果表明:在纳豆芽孢杆菌接种量6%、米曲霉接种量5%,初始水分55%、40℃发酵36 h后,再加入碱性蛋白酶8%、酸性蛋白酶2%,55℃酶解60 h,豆粕粗蛋白质含量由46.97%提高至51.95%,小肽含量由4.23%提高至61.04%,大豆球蛋白由158.42 mg/g降低至27.71 mg/g,β-伴大豆球蛋白由127.25 mg/g降低至6.46 mg/g。试验结果说明,在多菌株发酵后再经过复合酶酶解可显著提高豆粕蛋白质量。

关键词： IBV   反向遗传   BAC系统   感染性克隆  

摘要： 为构建IBV反向遗传感染性克隆平台,本研究在细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)反向遗传系统的基础上,对pCC1BAC载体进行改造,并利用无缝克隆技术,将pCC1BAC质粒作为骨架载体,在禽传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisvirus,IBV)基因组的5'端引入T7启动子序列以及3'端引入丁型肝炎病毒核酶序列(HDVRz)和多聚腺苷酸化尾巴序列,构建了IBVH120弱毒株的全长cDNA感染性克隆pBAC-H120。为区分亲本株与克隆株,将亲本株第16785、15786与15788位点核苷酸进行G到A、C到T及A到C的无义突变,即将GAG(Glu)CTA位点变为EcoR I GAA(Glu)TTC酶切位点作为遗传标记。将pBAC-H120感染性克隆与辅助质粒共转染BHK-21细胞,反复冻融离心后收获细胞液,将其接种至9日龄SPF鸡胚中,传代至5代后,收取尿囊液为重组病毒rH120提取病毒核酸并观察胚体,对收获的病毒进行鉴定。结果显示:基因序列分析rH120含有重组毒株遗传标记的无义突变,改造后的BAC反向遗传系统构建的感染性克隆pBAC-H120拯救成功,鸡胚实验显示重组毒株与亲本株具有相同生物特性的感染性病毒。本研究成功构建了基于改造BAC载体的IBV反向遗传操作系统,该平台为IBV致病相关基因的功能解析及病毒-宿主互作的分子机制研究提供了遗传学工具,为重组活载体疫苗设计及新型疫苗候选株的构建奠定了基础。

关键词： 动态牵张   三维培养   人骨髓间充质干细胞   成骨分化  

摘要： 目的:探究动态牵张对人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMMSCs)三维培养中成骨分化的促进作用。方法:对载有hBMMSCs的三维培养体系进行动态牵张,设置动态牵张的比例(5%、10%、20%)、频率(0.5Hz)和时间(2 h/d),以静态培养为对照组;通过胞质荧光染色观察动态牵张引起的hBMMSCs形变;动态牵张培养7 d后,通过细胞活死染色观察动态牵张对hBMMSCs活性的影响,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及定量实验,成骨相关基因和蛋白的表达观察动态牵张对hBMMSCs成骨分化的影响。结果:成功构建动态牵张三维培养hBMMSCs,可实现不同持续时间、频率和动态牵张的比例;动态牵张使得hBMMSCs发生形变,牵张比例越大,细胞形变越明显,从圆形向扁椭圆形变化;动态牵张培养7天后,静态对照组和动态牵张各实验组中hBMMSCs基本为绿染的活细胞,仅有个别红染的死细胞,活细胞比例各组之间的差异无统计学意义(P>0.05);动态牵张各组较静态对照组ALP大体染色深,镜下ALP染色阳性细胞数量多,成骨相关基因和蛋白的表达增加,差异具有统计学意义(P<0.05),其中动态牵张10%组ALP大体染色最深,阳性细胞数量最多,成骨相关基因和蛋白的表达较静态对照组增加最为显著。结论:动态牵张使得hBMMSCs发生形变,对细胞活性无明显影响,能够有效促进hBMMSCs成骨向分化。

关键词： 姜黄素   育肥猪   抗氧化能力   Keap1/Nrf2通路   脂多糖  

摘要： 【目的】旨在研究饲粮中添加姜黄素对脂多糖(LPS)诱导的育肥猪抗氧化功能和相关通路基因表达的影响。【方法】选取健康、体重相近(60 kg±0.45 kg)的杜×长×大三元育肥猪48头,随机分为4个处理组,每个处理组12个重复,每个重复1头育肥猪。对照组(CON)和脂多糖组(LPS)饲喂基础饲粮,姜黄素组(CUR组)和姜黄素+脂多糖组(CUR+LPS)在基础饲粮中额外添加500 mg/kg的姜黄素。LPS和CUR+LPS组在试验屠宰前12 h对育肥猪腹腔注射LPS,剂量为100 μg/kg BW,CON组同期注射等体积生理盐水,试验期为28 d。试验结束后,采集育肥猪的血清、肝脏及空肠组织样本,测定其相关抗氧化指标与基因mRNA相对表达水平。【结果】①与CON组相比,CUR组育肥猪终末体重和平均日增重显著升高(P<0.05),料重比显著降低(P<0.05)。②与CON组相比,LPS组育肥猪血清、肝脏及空肠中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P<0.05),丙二醛含量显著升高(P<0.05)。与CON组相比,CUR组育肥猪血清、肝脏及空肠总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性显著升高(P<0.05),丙二醛含量显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,CUR+LPS组育肥猪血清、肝脏及空肠中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性显著升高(P<0.05)。③在空肠Keap1-Nrf2通路基因表达方面,与CON组相比,LPS组育肥猪空肠Keap1 mRNA 表达显著上调(P<0.05),Nrf2、HO-1、SOD1、CAT mRNA 表达显著下调(P<0.05);CUR组则呈现相反显著变化趋势(P<0.05)。与LPS组相比,CUR+LPS组育肥猪空肠Keap1 mRNA表达显著下调(P<0.05),Nrf2、HO-1、SOD1、CAT mRNA表达显著上调(P<0.05)。【结论】姜黄素可通过调控Keap1/Nrf2信号通路的基因表达,缓解LPS诱导的育肥猪急性氧化应激损伤,为其在畜牧生产中作为天然抗氧化饲料添加剂,针对性防控育肥猪急性氧化应激、保障养殖健康提供理论依据与实践参考。

关键词： 蛋白质   核磁共振   机器学习  

摘要： 蛋白质本身是天然的功能材料,通过工程化手段,可以利用蛋白质的特性来开发新型生物材料,在生物医学等领域有广泛的应用。现在的人工智能技术已经可以根据氨基酸序列快速预测蛋白质结构,但是人们迫切需要一种能够快速验证蛋白质的结构或者蛋白质上与配体相互作用位点的方便快捷的实验方法。在目前主流解析蛋白质结构的实验方法中,液体核磁共振技术是样品准备最简单的方法,但对于包含50个以上氨基酸的蛋白质,使用液体核磁共振方法解析结构需要对目标蛋白质进行15N、13C同位素标记,然后才能进行后续的实验采集、谱峰归属等工作,这就大大限制了液体核磁共振技术在蛋白质结构与功能、蛋白质-配体相互作用研究等方面的应用。本研究引入前沿机器学习技术,把传统方法和最新人工智能模型预测的蛋白质化学位移相结合,开发了一种非标记蛋白质的核磁谱自动归属方法,可以快速完成50个以上氨基酸的蛋白质二维谱归属过程。本研究为没有生物核磁背景的用户提供了一种简单快速地利用核磁共振方法进行蛋白质相关研究的途径。

关键词： 单体氢同位素   微生物生物标志物   自养微生物   异养微生物   NADPH  

摘要： 微生物脂类生物标志物单体氢同位素(δD,‰)作为新兴的生物地球化学示踪工具,近年来在解析微生物代谢过程及重建古环境等领域凸显重要应用潜力。生物标志物的氢同位素分馏主要发生于微生物代谢过程,其分馏机制可归纳为微生物代谢类型的内在差异与环境变量的外在调控两大方面。文章系统梳理了不同营养类型微生物(光合自养型、化能自养型和异养型)脂类生物标志物氢同位素分馏机制的研究进展,重点对比了3种类型微生物氢同位素分馏特征及差异,并深入探讨由微生物代谢过程与环境因素综合影响所导致的分馏差异机理,根本原因在于生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的代谢途径不同。本综述旨在构建不同营养类型微生物生物标志物单体氢同位素分馏的理论框架,为利用其代用指标重建过去环境与生物地球化学循环变化提供科学支撑。

关键词： 芪芎左归复方   神经功能   脑卒中   大脑中动脉闭塞-再灌注   外泌体   大鼠  

摘要： 目的 研究芪芎左归复方调控骨髓间充质干细胞源性外泌体对衰老大脑中动脉闭塞-再灌注(MCAO/R)大鼠模型神经功能的影响。方法 按照随机数字表法将雄性SPF级SD大鼠分为5组:青年假手术组、衰老假手术组、衰老MCAO/R组、空白血清干预的外泌体组及含药血清干预的外泌体组,每组15只。除青年假手术组外,其余各组通过每日腹腔注射D-半乳糖(500 mg/kg,连续8周)建立衰老大鼠模型。末次注射后,衰老MCAO/R模型组、空白血清干预的外泌体组及含药血清干预的外泌体组接受MCAO/R手术。采用差速离心法提取外泌体,经透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析系统(NTA)粒径分析仪及蛋白质印迹法鉴定后,于MCAO/R术后24、72 h,外泌体组经尾静脉注射等体积的空白血清干预外泌体或含药血清(10%)干预的外泌体。MCAO/R术后7 d取材。通过2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色、Zea-Longa评分、Morris水迷宫实验分别检测脑梗死面积、神经功能缺损程度及学习记忆能力;采用HE染色、尼氏染色、高尔基-考克斯染色观察脑组织病理形态、尼氏体变化及神经元树突棘密度;利用免疫荧光及蛋白质印迹法检测神经元核抗原(NeuN)、微管相关蛋白2(MAP-2)蛋白表达情况。结果 与青年假手术组比较,衰老假手术组大鼠学习记忆能力下降,表现为逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短及穿越平台次数减少,同时尼氏体数量减少、神经元树突棘密度降低,NeuN和MAP-2蛋白表达水平下调(P<0.05);相较于衰老假手术组,衰老MCAO/R组大鼠神经功能缺损评分增加,逃避潜伏期延长、目标象限停留时间缩短、穿越平台次数减少,梗死区脑组织神经元坏死,尼氏体数量减少,神经元树突棘密度降低,NeuN及MAP-2蛋白表达下降(P<0.05);与衰老MCAO/R组比较,空白血清干预的外泌体组与含药血清干预的外泌体组神经功能缺损评分降低,脑组织病理学改善,尼氏体数量增多,逃避潜伏期缩短、目标象限停留时间延长、穿越平台次数增加,神经元树突棘密度上调,NeuN和MAP-2蛋白表达上升(P<0.05),且含药血清干预的外泌体组改善效果均优于空白血清干预的外泌体组(P<0.05)。结论 芪芎左归复方可能通过调控骨髓间充质干细胞源性外泌体,缓解衰老MCAO/R大鼠的脑组织病理学变化及减轻神经元损伤,从而提高学习记忆能力及恢复神经功能。

关键词： 转录组测序   鸡巨噬细胞   脂多糖   双特异性磷酸酶1   抗原递呈  

摘要： 为研究鸡巨噬细胞(HD11)在脂多糖(LPS)刺激下,抑制双特异性蛋白磷酸酶1(DUSP1)表达对细胞抗原递呈的影响,试验以HD11为材料,将DUSP1siRNA片段转染到HD11中,转染48 h后,每孔添加1μg LPS,于0、2、4、6 h收集细胞并抽提总RNA进行转录组测序,并对差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)进行分析。结果显示:在LPS刺激的整个时间段,筛选到1 121个共同DEGs,其中564个上调,557个下调;KEGG通路富集发现,DEGs显著富集在4条信号通路中,与免疫反应密切相关的信号通路有细胞因子-细胞因子受体相互作用和TGF-β信号通路。DUSP1与免疫相关通路的27个DEGs进行基因互作网络分析,发现DUSP1与CD40、SMAD7、CCL4、IL15、IL10作用最为密切,其中CD40与抗原递呈密切相关。CD80、CD86、CD1C低表达,影响抗原递呈相关基因(MHCI家族、MHCII家族、CD4、CD8A)表达激活。研究提示:抑制DUSP1表达会降低CD40、CD80、CD86、CD1C表达,抑制HD11递呈LPS的能力。

关键词： 莲房多糖   宫颈癌HeLa细胞   转录组学   蛋白组学   机制   糖酵解通路  

摘要： 为研究莲房多糖(lotus seedpod polysaccharide,LSP)抑制宫颈癌HeLa细胞的作用及其机制,本研究采用试剂盒法、流式细胞术、细胞划痕愈合实验、Transwell细胞迁移及侵袭实验分析LSP对HeLa细胞的抑制作用。联合转录组学、蛋白组学及Western blot技术明晰LSP抑制HeLa细胞的可能机制。结果表明,LSP能显著降低HeLa细胞的细胞活力,影响其细胞形态,诱导细胞凋亡和线粒体膜电位崩塌,促进活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成,抑制细胞的迁移和侵袭。转录组学分析显示,120 μg/mL LSP能显著调节HeLa细胞的12 347 个基因表达(5 550 个上调、6 797 个下调),改变生物过程、分子功能和细胞组分,调控代谢路径、氧化磷酸化、化学致癌物-ROS、细胞周期等通路。蛋白组学分析显示,120 μg/mL LSP能显著调节HeLa细胞的1 143 个蛋白表达(379 个上调、764 个下调),改变了生物过程、分子功能和细胞组分,调控磷酸戊糖途径、嘌呤代谢、糖酵解/糖异生、核苷酸代谢等通路。联合转录组学与蛋白组学分析显示,共同关联到的差异蛋白和差异基因有1 041 个,它们显著富集于糖酵解/糖异生、氨基糖和核苷酸糖代谢、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢等通路。进一步选择糖酵解/糖异生通路展开研究发现,LSP显著降低HeLa细胞的ATP含量、葡萄糖消耗量和乳酸生成量,抑制己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性,下调糖酵解通路中葡萄糖-6-磷酸异构酶、血小板型磷酸果糖激酶、肌肉型磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶A、丙糖磷酸异构酶1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶1、磷酸甘油酸变位酶1、烯醇化酶1、烯醇化酶2、烯醇化酶3、丙酮酸激酶M、乳酸脱氢酶A和乳酸脱氢酶B的蛋白表达水平。综上,LSP对HeLa细胞具有显著抑制作用,这可能与其显著抑制糖酵解通路有关。本研究结果可为LSP在宫颈癌防治中的功能开发与高值化利用提供理论依据。