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关键词： 手性   电子圆二色谱   理论计算   氨基酸  

摘要： 为适应现代学科交叉发展趋势的本科课程建设,本创新实验将电子圆二色光谱(ECD)仪器表征与量子化学计算结合,测定手性氨基酸图谱、筛选优化优势构象并计算理论光谱,通过对比实验与理论结果判定其绝对构型,并深入分析跃迁性质。本实验可以帮助学生掌握大型分析仪器的使用和ECD的理论计算方法,提升学生科研能力。

关键词： 鹰嘴豆芽素A   帕金森病   自噬   溶酶体   NLRP3炎性小体   脂多糖  

摘要： 目的 探究鹰嘴豆芽素A(biochanin A,Bioch A)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的帕金森病(Parkinson’s disease,PD)模型小鼠的神经保护作用及机制。方法 首先,取40只雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术(Sham)组、LPS 1 d组、LPS 3 d组、LPS 7 d组(n=10)。模型组小鼠黑质立体定位注射LPS溶液(2 g·L-1)构建PD模型,Sham组小鼠注射生理盐水。旷场、抓力实验检测小鼠的行为变化;免疫荧光检测黑质TH阳性神经元数量及LC3B表达;Western blot检测黑质TH及自噬-NLRP3炎性小体蛋白表达水平。随后,取50只雄性C57BL/6小鼠随机分为Sham组、LPS 7 d组、LPS + Bioch A(16、32、64 mg·kg-1)组(n=10)。造模后,Bioch A组小鼠灌胃Bioch A溶液,Sham组与LPS 7 d组小鼠灌胃超纯水,持续7 d。采用相同的检测方法,检测上述指标。结果 与Sham组相比,LPS组小鼠出现行为功能障碍(P<0.01),黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元损伤(P<0.01)、LC3B荧光信号增强(P<0.01)、自噬相关蛋白(LC3BⅡ/Ⅰ、Beclin-1、P62、CTSB)及NLRP3炎性小体相关蛋白表达均升高(P<0.01)。与LPS 7 d组相比,Bioch A干预可缓解上述变化(P<0.01)。结论 Bioch A可通过改善自噬溶酶体功能障碍,抑制NLRP3炎性小体激活,对LPS诱导的PD模型小鼠发挥神经保护作用。

关键词： 红芪多糖   蜜炙   分子量   糖醛酸   单糖组成  

摘要： 该文探究红芪蜜炙前后多糖的差异性。将红芪多糖(HPS)与炙红芪多糖(H-HPS)经梯度洗脱分离纯化后,采用紫外分光光度法测定红芪蜜炙前后不同洗脱组分中多糖和糖醛酸的含量,高效凝胶渗透色谱法(HPGFC)检测不同洗脱组分的分子量,离子色谱法(IC)检测不同洗脱组分的单糖组成及含量差异。结果显示,HPS和H-HPS经梯度洗脱后分别分离出3个不同组分,分别为蒸馏水洗脱组分、0.1 mol·L-1 NaCl洗脱组分、0.3 mol·L-1 NaCl洗脱组分;H-HPS各洗脱组分总糖含量与糖醛酸含量均高于HPS,且二者均呈现蒸馏水洗脱组分最高、0.1 mol·L-1 NaCl洗脱组分次之、0.3 mol·L-1 NaCl洗脱组分最低的分布规律。分子量分布显示,各洗脱组分结构均一,蜜炙后峰型对称性提高,均一性增强。不同离子强度洗脱时,随离子强度升高,多糖分布趋均、分子尺寸增大且稳定性提升;蜜炙使多糖整体分子量降低,分布变窄,相同洗脱条件下更趋稳定,尤其 0.3 mol·L-1 NaCl 洗脱组分呈现高均一性大尺寸特征。单糖组成层面,蜜炙引起各组分特征性变化:蒸馏水洗脱组分所含单糖种类最少;0.1 mol·L-1 NaCl洗脱组分新增岩藻糖,葡萄糖、木糖、甘露糖增加;0.3 mol·L-1 NaCl洗脱组分半乳糖醛酸含量倍增并成为特有组分,葡萄糖醛酸完全消失。该研究发现蜜炙处理通过水解与脱羧等反应,在显著提升多糖与糖醛酸含量的同时,重塑了其分子结构,可以为红芪蜜炙工艺的“增效”机制和红芪及其炮制品多糖的质量评价与开发应用提供理论基础。

关键词： 非酒精性脂肪肝病   红芪   黄芪   红芪多糖   线粒体自噬   PINK1/Parkin通路  

摘要： 该研究旨在对比红芪、黄芪及红芪多糖(HPS)干预非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的药效差异,并探究三者调节线粒体自噬改善NAFLD的作用机制。高脂饮食喂养C57BL/6J小鼠12周复制NAFLD模型,随机分为模型组、二甲双胍组(0.11g·kg-1·d-1)、红芪水煎剂组、黄芪水煎剂组、HPS组,各给药组连续灌胃4周,普通饲料喂养C57BL/6J小鼠作为对照组,对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃。观察小鼠一般情况并在第16周收集小鼠血清及肝组织,检测血清生化指标,评估肝功能;肝组织苏木精-伊红(HE)染色、油红O染色观察肝脏病理变化;透射电镜观察肝脏线粒体形态改变;试剂盒检测活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测空腹胰岛素(FINS)水平;实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)、微管自噬相关蛋白1轻链3(LC3)及选择性自噬接头蛋白1(P62)mRNA和蛋白表达水平。结果显示,与对照组相比,模型组小鼠体质量、肝质量、肝指数、空腹血糖、胰岛素、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯-葡萄糖指数(TyG)升高(P<0.01),高密度脂蛋白(HDL)降低(P<0.01),肝细胞脂肪变性明显,且线粒体结构受损、形态异常,肝组织活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)升高(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)降低(P<0.01),RT-qPCR和Western blot结果显示,模型组小鼠PTEN诱导激酶1(PINK1)、帕金蛋白(Parkin)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达水平降低(P<0.05,P<0.01),泛素结合蛋白P62 (P62)表达水平升高(P<0.01);与模型组相比,红芪、黄芪及HPS干预后,小鼠体质量、肝质量、肝指数、空腹血糖、胰岛素、ALT、AST、TC、TG、LDL、TyG水平降低(P<0.05,P<0.01),HDL水平升高(P<0.01),肝组织脂肪变性显著减轻,线粒体形态趋于正常,ROS、MDA含量明显降低(P<0.01),SOD活性升高(P<0.01);RT-qPCR结果显示,红芪、黄芪水煎剂组PINK1、Parkin、LC3 mRNA表达升高(P<0.05,P<0.01),P62 mRNA表达下降(P<0.01),HPS组LC3 mRNA表达升高(P<0.01),P62 mRNA表达下降(P<0.01),Western blot结果显示,红芪、黄芪水煎剂组PINK1、Parkin、LC3表达水平升高(P<0.05,P<0.01),P62表达水平降低(P<0.01),HPS组LC3水平升高(P<0.01),P62水平降低(P<0.01)。综上所述,红芪、黄芪可通过PINK1/Parkin通路调节线粒体自噬,改善NAFLD小鼠氧化应激及肝损伤,尤以红芪效果为佳,HPS虽能增加LC3、降低P62表达,但对PINK1/Parkin通路核心蛋白无显著调控作用,其具体机制有待进一步研究。

关键词： 肾小球肾炎,膜增生性   抗体,单克隆   免疫球蛋白G   病理学   利妥昔单抗   增生性肾小球肾炎伴单克隆免疫球蛋白沉积   靶向治疗  

摘要： 目的 分析膜增生性肾小球肾炎伴单克隆免疫球蛋白沉积(PGNMID)的临床及病理特征、治疗方法与转归。方法 回顾性分析我院经肾穿刺活检确诊的3例PGNMID患者的临床资料、病理资料、治疗方案及预后特点,探讨发病机制并评价不同治疗方法的疗效。结果 3例PGNMID患者均为女性,平均年龄(68.00±12.29)岁,均表现为肾小球源性血尿、大量蛋白尿及不同程度肾功能损伤。肾活检病理光镜下均以膜增生性肾炎为特征,免疫荧光可见IgG亚型免疫球蛋白及轻链沉积于毛细血管襻与系膜区,均伴补体C3沉积,电镜下均可见足突弥漫性融合(>95%),电子致密物沉积于内皮下及系膜区,其中2例基底膜内亦可见电子致密物沉积。3例患者均采用肾素-血管紧张素转化酶抑制剂联合针对致病B细胞或浆细胞克隆实施靶向治疗,1个月后24 h尿蛋白定量均有不同程度下降。2例患者在治疗2~3个月时达到部分缓解,在第6~7个月达完全缓解,1例患者经治疗后随访至6个月仍为部分缓解。结论PGNMID患者常表现为肾病综合征并伴有肾功能减退,病理上常以IgG3沉积的膜增生性肾小球肾炎为特征,早期诊治可获得较好临床治疗效果。

关键词： 克隆”电子游戏   思想   表达二分法   游戏规则   著作权保护   多元共治  

摘要： “克隆”电子游戏因在玩法机制、视觉呈现和交互体验等方面对原作进行高度模仿在版权保护方面存在极大争议。以英国、欧盟与美国之比较表明,遏制规避型侵权的关键在于明晰规则与表达的边界,并建立可操作的认定方法。我国学界与实务界关于“克隆”电子游戏版权保护的争议主要集中在游戏规则的法律属性认定标准未统一、侵权比对方法存在适用分歧、公共领域与创作者权益平衡标准不明,这是因为现行法律在游戏表达结构保护、裁判标准统一性、多元规制机制等方面存在不足。因此,在立法上应明确游戏表达之结构性要素的保护标准,在司法上应构建兼顾整体感受与要素分析的多维判断框架,在行业上应形成平台审查、行业自律与技术鉴定相结合的多元共治体系。

关键词： 蜱Rho-1   非洲猪瘟病毒   重组蛋白   多克隆抗体  

摘要： 本研究围绕蜱Rho-1的蛋白结构特征、蛋白表达体系构建及其抗非洲猪瘟病毒功能开展系统研究:首先对Rho-1进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET-28a-Rho-1与真核表达载体pCDNA3.1-Flag-Rho-1,获得纯化的重组蛋白;随后免疫BALB/c小鼠制备Rho-1多克隆抗体,结合Westernblotting与Co-IP对抗体的特异性进行验证;进一步在PAMs细胞中评估Rho-1重组蛋白的细胞毒性,并采用Westernblotting、qPCR与HAD50 综合检测其对ASFV复制的影响。结果显示,Rho-1蛋白在不同物种中较为保守,整体呈亲水特征,不含信号肽和跨膜区,具有多个潜在磷酸化位点;原核诱导表达获得约25kDa目的蛋白并成功纯化。ELISA检测显示,该多克隆抗体效价高达1:32000。进一步研究表明,该抗体不仅能够稳定识别重组Rho-1蛋白和HEK293T细胞外源表达的Flag-Rho-1蛋白,还可检测OME/CTVM24蜱细胞中的内源性Rho-1蛋白及蜱样品中的天然Rho-1蛋白,说明所制备抗体具有较好的特异性和应用价值。另外,Rho-1重组蛋白在无明显细胞毒性的条件下对ASFV复制呈剂量相关抑制作用,高剂量处理可降低病毒蛋白表达、病毒转录水平及病毒滴度。制备的Rho-1重组蛋白及其多克隆抗体为解析蜱蛋白介导的抗ASFV 机制及后续抗病毒治疗开发提供实验材料。

关键词： 离子排斥色谱法   复方氨基酸注射液(14AA)   甘油   醋酸   亚硫酸氢钠  

摘要： 采用离子排斥色谱法,建立了同时测定复方氨基酸注射液(14AA)中甘油、醋酸及亚硫酸氢钠的方法。色谱柱采用Xtimate Sugar-H柱(300 mm×7.8 mm,5μm),流动相为7.5 mmol/L硫酸溶液,等度洗脱,流速为0.5mL/min,检测波长200 nm,柱温为65℃,进样量为10μL。以紫外检测器进行检测,外标法定量。结果表明,本方法专属性良好,氨基酸成分不干扰甘油、醋酸及亚硫酸根测定,主峰与相邻色谱峰分离度良好,甘油、醋酸及亚硫酸根在一定范围内线性关系良好,相关系数(r)均>0.999 5。针对3种成分进行了低、中、高3个水平的加标回收试验,目标物的平均回收率为99.21%~102.6%,相对标准偏差(RSD,n=3)为0.09%~0.86%。该方法能够有效解决氨基酸成分的干扰,快速简便,专属性强,准确度高,可用于复方氨基酸注射液(14AA)中甘油、醋酸及亚硫酸氢钠的含量测定。

关键词： 烟叶   蛋白质降解菌   蛋白酶   诱变选育   发酵条件优化  

摘要： 为了获得高效降解烟叶蛋白质的微生物菌株,发掘具有工业应用价值的微生物资源,本研究以短小芽孢杆菌Bacillus pumilus ZG7作为出发菌株,采用改良易错PCR技术对ZG7菌株进行诱变选育,通过透明圈法初筛正突变菌株,福林酚法对正突变菌株的蛋白酶活力进行量化测定,并通过SDS-PAGE法表征不同蛋白酶的表达情况,再通过响应面法明晰突变株的最佳发酵条件,考察了突变株对烟叶(云烟87)蛋白质的降解效果及处理后烟叶的感官质量效果。结果表明,筛选获得的优质产蛋白酶突变株B. pumilus ZG7-1的产蛋白酶活力为168.33 U/mL,比出发菌株提高213.81%。突变株ZG7-1显著增强了分子质量约为28 kDa和58 kDa蛋白酶的表达,并新增了分子质量约72 kDa的蛋白酶。在单因素试验的基础上,通过响应面试验优化突变株ZG7-1的产酶条件,突变株ZG7-1的最佳产蛋白酶条件确定为:蔗糖18.60 g/L、氯化镁 3.48 g/L、接种量4.81%,在此条件下,发酵酶活可达491.50±3.06 U/mL,是未优化之前的2.92倍。通过ZG7-1突变株菌液处理烟叶,烟叶蛋白质降解率为27.05%,且烟叶感官质量得到明显提升。研究表明,突变株ZG7-1具有较强的产蛋白酶能力且遗传稳定性较高,可高效降解烟叶蛋白质,提高烟叶品质,具有较好的应用前景。

关键词： 婴儿配方乳粉   α-乳白蛋白   β-酪蛋白   体内消化吸收  

摘要： 母乳与婴儿配方乳粉在蛋白质组成及比例上存在显著差异。在乳清蛋白与酪蛋白为60:40的条件下,评估α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-La)和β-酪蛋白(β-casein,β-CN)不同强化比例及不同β-CN亚型的婴儿配方乳粉在体内的消化与吸收特性。基于SD幼鼠模型,分析血清中氨基酸和矿物质水平及其相关转运载体、紧密连接蛋白的表达,并结合多肽组学揭示蛋白质吸收机制。结果表明,α-La和β-CN强化显著提高了血清中120 min游离氨基酸和矿物质水平。氨基酸及小肽转运载体蛋白(SLC1A1、SLC6A14、SLC6A19、PEPT1)、矿物质转运蛋白(TRPV4、TRPV6、ZnT1、FPN)的表达水平也显著提升(P < 0.05),但相同强化水平不同β-CN亚型间未见显著差异。紧密连接蛋白Occludin和ZO-1在吸收过程中呈上下波动变化。灌胃60 min后,血清中检测到β-CN来源的YPVEP、GVSKVKEAMAPK和SLSQSKVLPVPQKAVPYPQ等衍生肽段在强化组中相对丰度升高,但不同强化水平及亚型间差异不显著。本研究为婴儿配方乳粉蛋白质比例优化提供了理论依据。