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关键词： 加味玉屏风多糖   免疫抑制   Keap1/Nrf2信号通路   抗氧化   PI3K/AKT信号通路  

摘要： 旨在揭示加味玉屏风多糖(JYP)调节免疫抑制的作用机制,为其临床应用提供理论依据。利用网络药理学分析JYP调节免疫抑制疾病的“成分-靶标-通路”分子机制,通过RAW264.7细胞和环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型进行体内外试验验证。网络药理学分析显示,JYP与免疫抑制疾病存在49个共同靶点,主要富集于PI3K/AKT信号通路和氧化应激反应。体外试验表明,31.25~125μg/mL浓度内的JYP可显著增加上清液中NO含量(P<0.05),上调过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的基因表达。动物试验证实,JYP干预显著提升小鼠回肠组织中PI3K、AKT和Nrf2蛋白表达(P<0.05),同时抑制Keap1蛋白表达。综上所述,JYP能够通过激活Keap1/Nrf2抗氧化防御通路和PI3K/Akt信号通路,发挥抗氧化与免疫调节的双重效应。

关键词： 艾司氯胺酮   肌细胞,心脏   细胞损伤   凋亡   内质网应激   脂多糖  

摘要： 目的观察艾司氯胺酮对脂多糖诱导的心肌细胞内质网应激(ERS)与细胞凋亡的影响。方法2022年1—12月,采用脂多糖处理的H9c2细胞为心肌细胞毒模型,将细胞分为空白组(正常培养,不进行任何处理)、模型组(1 mg/L脂多糖处理H9c2细胞)及艾司氯胺酮组(8 mg/L艾司氯胺酮和1 mg/L脂多糖共同处理H9c2细胞)。处理24 h后,检测并比较各组H9c2细胞凋亡数量,细胞内凋亡蛋白胱天蛋白酶3(caspase-3)、胱天蛋白酶12(caspase-12)及多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1),细胞内活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)活性,培养上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β蛋白水平及细胞内TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平。检测并比较各组细胞ERS相关分子钙连蛋白、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(p-PERK)、磷酸化真核翻译起始因子2α(p-eIF2α)蛋白水平。结果空白组、模型组及艾司氯胺酮组细胞晚期凋亡率分别为(1.88±0.17)%、(14.03±1.92)%、(5.68±1.43)%,钙连蛋白水平(荧光强度)分别为25.10±5.72、582.71±43.03、107.11±19.89。与空白组相比,模型组细胞凋亡细胞数量,活化PARP1/PARP1、活化caspase-3/caspase-3及活化caspase-12/caspase-12,细胞内活性氧、丙二醛及TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA水平,细胞培养上清TNF-α、IL-6、IL-1β蛋白水平,细胞内钙连蛋白、GRP78、CHOP蛋白水平,p-PERK、p-eIF2α蛋白水平显著增加(P<0.05),而艾司氯胺酮组上述指标水平显著低于模型组(P<0.05)。同时模型组SOD活性显著低于空白组(P<0.05),而艾司氯胺酮组SOD活性显著高于模型组(P<0.05),但低于空白组(P<0.05)。结论在H9c2细胞中,艾司氯胺酮能够抑制细胞凋亡,改善脂多糖诱导的ERS及炎症反应,这可能对减轻心肌细胞损伤有所帮助。

关键词： 血小板   冠心病痰瘀互结证   小型猪   丹蒌片   蛋白质组学  

摘要： 目的:观察丹蒌片通过改善血小板功能发挥治疗小型猪痰瘀互结证冠心病的作用,应用蛋白质组学技术探讨丹蒌片调控血小板功能的潜在药理作用机制。方法:将30头巴马小型猪随机分为正常组(6头)和高脂饲料喂养组(24头)。高脂喂养组给予高脂饲料喂养2周后,随机分为模型组、阿托伐他汀组(1 mg·kg^(-1))、丹蒌片高剂量组(0.6 g·kg^(-1))、丹蒌片低剂量组(0.3 g·kg^(-1))。术后继续给予高脂饲料喂养8周。正常组给予普通饲料,仅冠脉造影,不行介入损伤术。模型组及各给药组高脂饲料喂养,2周后进行冠脉损伤术,术后每天上午将药物拌于饲料中喂养,连续给药8周,术后持续高脂饲料喂养。进一步通过定量蛋白质组学技术对血小板蛋白进行研究,筛选得到差异蛋白,并通过生物信息学分析丹蒌片治疗痰瘀互结证冠心病的关键调节蛋白及生物途径。结果:与正常组比较,模型组小型猪血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)显著升高(P<0.01),凝血功能指标凝血酶原时间(PT)显著缩短(P<0.01),全血血液黏度升高(P<0.01),血小板聚集率升高(P<0.01),血小板形态发生改变,内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)含量显著升高(P<0.01),血流动力学指标明显异常,收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MAP)、左心室收缩压(LVSP)、左心室压力上升最大速率(LV+dp/dtmax)均显著降低(P<0.01),左心室压力下降最大速率(LV-dp/dtmax)显著增加(P<0.01),心肌细胞肥大,水肿变性明显,间质大量炎细胞浸润,纤维化程度较高,冠状动脉内皮脉粥样硬化形成;与模型组比较,丹蒌片高、低剂量组均能明显降低血清TC、TG水平(P<0.05,P<0.01),丹蒌片0.6 g·kg^(-1)组可明显降低LDL-C(P<0.05),明显降低低切及高切状态下全血黏度(P<0.05),丹蒌片组各剂量组均能明显降低最大聚集率(MAR)和平均聚集率(AAR)(P<0.05,P<0.01),并且减少血小板伪足伸出等形态改变,明显降低血清ET-1水平,丹蒌片0.6 g·kg^(-1)组明显降低血清NO水平(P<0.05),丹蒌片各剂量组均能明显升高DBP、MAP(P<0.05),丹蒌片0.6 g·kg^(-1)组LVSP、LV+dp/dtmax明显增加(P<0.05,P<0.01),LV-dp/dtmax明显降低(P<0.05),丹蒌片各剂量组的心肌组织水肿变性较轻,冠状动脉病变程度明显减轻;与正常组比较,在模型组中共有94个差异表达蛋白,其中上调蛋白81个,下调蛋白13个;与模型组比较,在丹蒌片0.6 g·kg^(-1)组共有174个差异表达蛋白,其中上调蛋白100个,下调蛋白74个。经丹蒌片药物干预后回调蛋白共有30个,生物信息学分析发现其药理机制可能通过肌动蛋白细胞骨架的调控、血小板活化通路、Fcγ受体介导的吞噬作用等生物途径,以及生长因子受体结合蛋白2(GRB2)、Ras相关C3肉毒素底物2(RAC2)、RAC1、热休克蛋白90αA1(HSP90AA1)等蛋白,发挥抗血小板激活、聚集、黏附等药理作用。结论:丹蒌片可有效减少血小板活化、聚集,对于小型猪痰瘀互结证冠心病有着良好的治疗效果,其药理机制可能是通过肌动蛋白细胞骨架的调控、血小板活化通路等生物途径,以及调控GRB2、RAC2、RAC1、HSP90AA1等蛋白,发挥抗血小板激活、聚集、黏附等药理作用。

关键词： 豚鼠   构建黄褐斑模型   蛋白质组学分析   潜在靶点  

摘要： 目的构建中波紫外线(ultraviolet B,UVB)诱导的豚鼠黄褐斑模型,揭示该模型的形成机制并分析其潜在的治疗靶点。方法测定最小红斑量(minimal erythema dose,MED)确定模型的辐照剂量;测定皮肤灰度值、HE及Masson-Fontana染色进行模型评估。确认造模成功后,利用蛋白质组学技术筛选UVB照射组(U)和空白组(C)豚鼠皮肤组织的差异蛋白并进行生物信息学分析;以黄褐斑(Melasma,Chloasma)为主题词查询疾病靶点,筛选去重后联合蛋白质组学差异蛋白结果构建蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,筛选出前5位的差异表达蛋白并进行实验验证。结果造模后与C组相比,U组豚鼠表现出明显的黑色素沉积。蛋白质组学结果显示,U组与C组存在187个差异表达蛋白;同源蛋白簇(cluster of orthologous group,COG)注释中脂质转运及代谢占比较高;基因本体(gene ontology,GO)富集分析表明差异蛋白主要参与代谢过程;京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclo pedia of genes and genomes,KEGG)分析主要富集到脂质代谢、脂肪酸代谢、氧化磷酸化等过程;PPI分析发现黑素皮质素受体1(melanocortin 1 receptor,MC1R)、蛋白激酶cAMP激活的催化亚基α(protein kinase CAMP-activated catalytic subunit alpha,PRKACα)、囊性纤维化跨膜传导调节因子(CF transmembrane conductance regulator,CFTR)、CD分子4(cluster of differentiation 4,CD4)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)位于相互作用网络的关键节点。实验验证结果显示,与C组相比,U组豚鼠皮肤组织内MC1R、PRKACa、CFTR、CD4、ESR1的表达水平升高(P<0.05)。结论UVB辐照雌性棕黄色豚鼠可以成功诱导建立黄褐斑模型;MC1R、PRKACα、CFTR、CD4、ESR1可能与UVB诱导的黄褐斑的发病密切相关。

关键词： 棉铃虫   细胞色素P450   基因克隆   原核表达纯化   多克隆抗体  

摘要： 【目的】通过克隆及表达棉铃虫CYP6AE17和CYP6AE19基因,制备鼠抗棉铃虫细胞色素P450(CYP6AE17、CYP6AE19)多克隆抗体,为进一步研究细胞色素P450酶在棉铃虫中的功能奠定基础,为棉铃虫的绿色防控提供理论依据。【方法】构建重组质粒pET32a-CYP6AE,诱导表达并纯化重组蛋白,将其作为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体,利用ELISA检测多克隆抗体的效价,通过Western blot检测多克隆抗体的特异性。【结果】CYP6AE17、CYP6AE19基因CDS序列全长分别为1572和1587 bp,分别编码523和528个氨基酸。SDS-PAGE分析结果表明,CYP6AE17和CYP6AE19基因均可在大肠杆菌原核表达系统中高效诱导表达,重组蛋白主要以包涵体形式存在。ELISA结果表明,制备的鼠抗棉铃虫CYP6AE17和CYP6AE19多克隆抗体效价分别达1∶1024000和1∶512000,且均可特异性识别棉铃虫体内的天然P450蛋白。【结论】该研究结果为进一步深入研究棉铃虫细胞色素P450酶的功能奠定了材料基础,为棉铃虫防治新靶标的开发提供了理论依据。

关键词： 猪萨佩罗病毒   3D蛋白   原核表达   多克隆抗体  

摘要： 旨在制备猪萨佩罗病毒(PSV)3D蛋白的多克隆抗体。本研究通过扩增PSV 3D基因,构建重组原核表达质粒pET-30a-3D,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21诱导表达,将诱导后表达的3D蛋白纯化,免疫兔制备了抗PSV 3D的多克隆抗体。结果:经SDS-PAGE和Western blot分析确认,所表达的3D蛋白质分子量大约为56 ku,与预期大小相吻合;将纯化后的重组蛋白3D免疫兔,制备了兔抗3D蛋白多克隆抗体。酶联免疫吸附试验显示,兔源3D蛋白抗体的效价高达1∶100 000以上;间接免疫荧光和Western blot试验结果所示,该抗体对PSV感染过程中表达的3D蛋白具有良好的反应性。综上,本研究成功制备抗3D多克隆抗体,为后续的PSV-3D蛋白功能探索及病原诊断提供了材料。

关键词： 万寿菊   株高   TeGA20ox   表达分析  

摘要： GA20氧化酶是赤霉素生物合成途径中的重要氧化酶,在植物株高调控中发挥着重要作用。为研究 TeGA20ox在万寿菊中的生物功能,本文以万寿菊矮杆品系‘c-16’、中杆品系‘72’、高杆品系‘2-2’为试验材料,采用同源克隆结合RACE技术获得 TeGA20ox基因全长,对其进行生物信息学分析、亚细胞定位,并用qRT-PCR技术检测 TeGA20ox基因在万寿菊不同时期以及不同组织中的表达量。结果表明,克隆到万寿菊 TeGA20ox基因全长为1 550 bp, CDS长度1 149 bp,共编码382个氨基酸。TeGA20ox蛋白分子质量43.55 ku,为亲水蛋白且无跨膜结构,TeGA20ox蛋白与菊薯、向日葵、微甘菊亲缘关系较近。并构建表达载体瞬时转化烟草,该蛋白定位于细胞膜和内质网上。‘72’和‘2-2’的表达量随着株高的增高逐渐升高,呈正相关趋势。 TeGA20ox在万寿菊不同组织中的表达存在差异,矮杆品系‘c-16’中 TeGA20ox的最高表达部位为幼嫩叶片,而中杆品系‘72’和高杆品系‘2-2’中茎表达量最高。以上结果表明 TeGA20ox基因的表达与万寿菊株高存在一定关系, TeGA20ox在万寿菊株高调控方面起到了重要作用。

关键词： 骨髓间充质干细胞   蛇床子素   高糖环境   成骨分化   糖尿病   骨愈合  

摘要： 背景:糖尿病患者的高血糖状态会损害骨髓间充质干细胞的功能,导致骨愈合障碍等并发症。蛇床子素作为一种天然香豆素类化合物,具有促进成骨分化的潜在作用。目的:探讨蛇床子素对高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化功能的影响。方法:采用CCK-8方法确定高糖环境影响骨髓间充质干细胞的最适浓度及作用时间,以及蛇床子素的最佳作用浓度和时间;将骨髓间充质干细胞分为4组:空白组仅添加基础培养基培养,对照组添加成骨诱导培养基培养,高糖组在成骨诱导培养基的基础上添加25 mmol/L葡萄糖,蛇床子素组在高糖组的基础上添加80μg/mL蛇床子素。采用碱性磷酸酶活性检测和茜素红染色定量分析评估骨髓间充质干细胞的成骨分化表型;实时荧光定量PCR和免疫荧光技术检测成骨相关因子的表达变化。结果与结论:①CCK-8实验确定使用25 mmol/L高糖培养基培养3 d构建体外高糖环境模型,蛇床子素的最佳作用质量浓度为80μg/mL,最佳作用时间为3 d;②在高糖环境下,蛇床子素显著增强了骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶活性和矿化结节形成能力;③与高糖组相比,蛇床子素组Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原和骨钙素基因表达显著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001);④与高糖组相比,蛇床子素组Runx2和骨钙素蛋白表达显著增加(P<0.0001)。结果表明,蛇床子素在高糖环境中可改善骨髓间充质干细胞的成骨分化功能。

关键词： 黄水   多糖   响应面优化   抗氧化   降血糖   酶动力学  

摘要： 为促进白酒酿造副产物黄水的高值化利用,本研究以黄水为原料,以黄水粗多糖(crude Huangshui polysaccharide,c HSP)得率为评价指标,结合单因素实验和响应面法优化cHSP的醇沉工艺。在此基础上,采用酶法脱蛋白制备黄水多糖(Huangshui polysaccharide,HSP),并评价其体外抗氧化及降血糖活性,进一步通过酶动力学分析HSP对α-淀粉酶的抑制机制。结果表明,cHSP的最佳醇沉工艺为:温度5.8℃、时间14.3 h、乙醇体积比1:5,在此条件下c HSP得率为7.36±0.03 mg/mL。体外活性研究表明,HSP对ABTS^(+)、DPPH及羟基自由基的清除能力较强,其IC_(50)值分别为3.38、1.53和3.36 mg/mL;同时,HSP对α-葡萄糖苷酶、胰淀粉酶和α-淀粉酶的IC_(50)值分别为3.75、2.40和2.08 mg/mL,表明其具有潜在的降血糖功效。酶动力学分析表明:HSP对α-淀粉酶的抑制类型为混合型抑制,抑制常数(KI)为4.21 mg/mL,低于酶-底物复合物抑制常数(K_(IS)=8.62 mg/mL),说明HSP对游离酶的结合能力更强。本研究结果表明,黄水多糖具有一定的抗氧化活性和较好的α-淀粉酶抑制能力,在天然抗氧化剂和降血糖功能食品开发中具有潜在的应用价值。

关键词： 番鸭   MAPK1蛋白   原核表达   多克隆抗体   表达定位  

摘要： 【目的】制备番鸭丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase,MAPK1)蛋白多克隆抗体,鉴定其特异性与适用性,并探究MAPK1蛋白在卵泡颗粒细胞及卵泡中的表达定位,为研究其在番鸭卵泡发育与生殖调控中的功能提供试验工具。【方法】以番鸭卵巢组织cDNA为模板,通过PCR扩增MAPK1基因并测序,运用生物信息学工具分析MAPK1蛋白理化性质及主要抗原表位,筛选免疫原区段。对免疫原序列进行大肠杆菌密码子优化并人工合成,经同源重组克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达载体pET30a-MAPK1并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。在HB-PET自诱导培养基中表达、纯化MAPK1重组蛋白,将纯化蛋白与QuickAntibody-Rabbit8W佐剂混合后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blotting、细胞免疫荧光(CIF)、组织免疫荧光(TIF)和免疫组化(IHC)等方法检测多克隆抗体的效价、特异性与适用性,并以颗粒细胞标志物促卵泡激素受体(FSHR)为参照分析MAPK1表达定位。【结果】成功克隆了番鸭MAPK1基因,大小约1107 bp,编码368个氨基酸。MAPK1蛋白理论分子质量约42 ku。生物信息学预测显示,MAPK1蛋白不含信号肽和跨膜结构;第50—100、200—300和250—350位氨基酸区段亲水性良好,第30—90和200—300氨基酸区段抗原指数较高,第30—70、120—150、200—260及320—360位氨基酸区段的氨基酸表面暴露概率较大。MAPK1蛋白二级结构以α-螺旋为主,包含典型激酶保守结构,活化环呈无规则卷曲状态,主要定位于细胞质和细胞核。综合蛋白特性,最终筛选了第4—364位氨基酸作为候选免疫原区段。成功构建原核重组表达载体pET30-MAPK1,MAPK1重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量约48 ku。成功制备了兔抗鸭MAPK1蛋白多克隆抗体,ELISA结果显示该抗体效价达1∶102400;Western blotting、CIF、TIF和IHC结果显示,制备的多克隆抗体可特异识别MAPK1重组蛋白及番鸭卵泡颗粒细胞和卵泡中的内源性MAPK1蛋白。在颗粒细胞中,MAPK1主要定位于卵泡颗粒细胞的细胞质和细胞核;在卵泡中,MAPK1主要分布于卵泡颗粒细胞层,表达定位与FSHR基本一致。【结论】试验成功制备了番鸭MAPK1多克隆抗体,该抗体特异性良好,适用于番鸭卵泡相关细胞与组织样本中MAPK1的免疫学检测。研究结果为MAPK1在卵泡发育及生殖调控中的功能研究提供了技术支撑。