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关键词： 脐带血   蛋白质组学   神经发育   出生队列  

摘要： 目的:利用前瞻性出生队列,通过高通量蛋白质组学技术,系统探讨脐带血蛋白质表达谱与婴儿早期神经心理发育的关联,识别潜在的早期生物标志物,并探索其背后的生物学机制,为在普通人群中早期识别神经发育风险、理解神经发育偏离的分子基础提供科学依据。方法:研究基于北京大学通州出生队列,纳入96例在1岁和3岁时完成《年龄与发育进程问卷(第三版)》(ages & stages questionnaires, third edition,ASQ-3)评估的儿童。根据 ASQ-3筛查结果将其分为异常组(n=42)和对照组(n=54)。检测并分析出生时冻存的脐带血血浆样本,采用非靶向定量蛋白质组学技术进行无偏倚筛查。通过差异表达分析、主成分分析(principal component analysis,PCA)、正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)及加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)等方法,识别差异表达蛋白质并进行基因本体论(gene ontology,GO)功能富集与京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,计算差异倍数(fold change,FC)。统计学检验采用独立样本t检验,多重检验校正采用 Benjamini-Hochberg法计算错误发现率(false discovery rate,FDR)。结果:蛋白质组学分析共鉴定出8 214个共有蛋白质,与对照组比较,在异常组中385个为差异表达蛋白质(P<0.05,|log2(FC)|>0.585),其中189个上调,196个下调。PCA和OPLS-DA 分析显示两组样本存在系统性蛋白质表达差异。WGCNA 分析鉴定出10个共表达模块,其中黄色模块与 ASQ-3 异常分组显著负相关(r=-0.23,P=0.024),粉色模块与沟通维度评分显著正相关(r=0.30,P=0.003)。富集分析表明,差异表达蛋白质及关键模块主要富集于两大功能通路:(1)遗传信息处理通路,包括核糖体、剪接体及 mRNA 加工;(2)细胞骨架组织与 Wnt 信号通路,这些通路在神经发育障碍的发病机制中具有重要生物学意义。结论:脐带血中遗传信息处理及细胞骨架组织与Wnt 信号通路相关蛋白质的扰动,可能是婴儿早期神经发育筛查异常的重要分子特征。本研究为在普通人群中早期识别神经发育风险提供了潜在的外周血生物标志物组合,并为理解神经发育偏离的生物学机制提供了新视角;未来需在更大规模队列中验证这些发现,并通过功能实验阐明关键蛋白质的具体作用机制。

关键词： 2型人博卡病毒   VP3蛋白DR2区   单克隆抗体   特异性   亲和力  

摘要： 目的制备针对2型人博卡病毒(Human bocavirus, HBoVs)VP3蛋白DR2多肽的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并系统鉴定其特异性、亲和力。方法 针对HBoV2与HBoV1 VP3蛋白差异最显著的DR2区,合成特异性多肽并免疫BALB/c小鼠。通过细胞融合、杂交瘤筛选法,获得稳定分泌抗HBoV2-DR2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)鉴定抗体的特异性;利用生物膜层干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)测定抗体亲和力常数(KD)。结果 成功获得一株稳定分泌抗HBoV2-DR2 mAb的杂交瘤细胞株,命名为3A6,亚类鉴定为IgG1/κ型。ELISA和IFA结果显示,mAb 3A6与原核表达的HBoV2 VP3及表达HBoV2 VP3的细胞呈强阳性反应,而与HBoV1 VP3仅存在弱反应,与表达HBoV1 VP3的细胞未见阳性反应;在BLI检测中,其与HBoV2 VP3亲和力高,KD值达2.09×10?10M,与HBoV1 VP3未见显著结合,无KD值;提示3A6的区别于HBoV1的HBoV2型特异性。结论 本研究成功制备了一株具有高亲和力的抗HBoV2 DR2区的单克隆抗体,为HBoV2诊断试剂及药物研发奠定基础。

关键词： 非洲猪瘟病毒   CRISPR/Cas9系统   WSL细胞系   Cas9蛋白   易感性  

摘要： 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)入侵细胞的分子机制尚未完全阐明,尤其是其关键受体仍不明确,已成为高效疫苗和靶向药物研发的主要瓶颈。为建立支持ASFV高效复制且可用于全基因组CRISPR筛选的可靠实验平台,系统鉴定介导ASFV入侵的关键宿主因子,本研究利用CRISPR/Cas9系统,以野猪肺细胞系(WSL细胞系)为基础构建稳定表达Cas9蛋白的单克隆细胞系。通过慢病毒载体系统包装表达Cas9蛋白及杀稻瘟菌素(blasticidin)抗性基因的重组慢病毒,并将其转导至WSL细胞。经blasticidin压力筛选获得稳定表达Cas9蛋白的混合细胞池后,采用流式细胞分选技术进行单克隆化培养,获得稳定表达Cas9蛋白的单克隆细胞株,并利用Western blotting检测Cas9蛋白的表达水平。为进一步评估所构建细胞系的基因剪切功能活性,将携带EGFP报告基因及其特异性单向导RNA(single-guide RNA, sgRNA)的慢病毒转导至上述单克隆细胞株,通过流式细胞术定量分析基因编辑效率。此外,针对ASFV的B646L基因和宿主的TMEM239基因设计并合成特异性sgRNA,进一步评价该细胞系对ASFV及宿主基因的编辑效果。结果表明,成功建立了7株稳定表达Cas9蛋白的WSL-Cas9单克隆细胞系,其中编号为WSL-Cas9-3#的细胞株表现出最高的基因编辑效率,可实现对ASFV及宿主基因的有效编辑,且具有良好的遗传稳定性与正常的生长特性。本研究成功构建了一株具备高效CRISPR/Cas9编辑能力、生长特性稳定且支持ASFV高效复制的WSL-Cas9单克隆细胞系,为后续开展全基因组范围的功能筛选、系统解析宿主中调控ASFV入侵的关键因子提供了可靠的实验平台,也为深入探究病毒-宿主相互作用机制奠定了重要的技术基础。

关键词： 西洋参多糖(AGP)   人参稀有皂苷(HTS)   RAW264.7   巨噬细胞极化   抗炎  

摘要： 为探讨西洋参多糖(AGP)与人参稀有皂苷(HTS)联合对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞炎症的抗炎作用及其分子机制,研究采用CCK-8法评估不同质量浓度的AGP、HTS及其联用对细胞活力的影响,确定三者安全给药质量浓度范围及LPS最佳造模质量浓度。实验分为空白对照组、模型组、HTS组、AGP组及HTS+AGP组,处理24 h后通过倒置显微镜观察细胞形态,采用Griess法测定NO含量,ELISA检测TNF-α与IL-6水平,免疫荧光与RT-q PCR分析TNF-α、CD68和CD163的表达。结果显示,HTS+AGP组细胞存活率显著高于HTS组(IC50分别为280.50μg·m L-1和149.40μg·mL-1),且AGP具有促细胞增殖作用。在LPS诱导的炎症模型中,HTS+AGP干预显著抑制NO释放、TNF-α(模型组473.12 pg·mL-1;HTS+AGP组366.58 pg·mL-1)和IL-6(模型组61.92 pg·mL-1;HTS+AGP组33.07 pg·mL-1)。RT-q PCR与免疫荧光结果表明,HTS+AGP可下调M1型标志物CD68与TNF-α mRNA表达,上调M2型标志物CD163 mRNA表达,有效逆转LPS诱导的巨噬细胞M1型极化。综上所述,AGP与HTS联用可通过抑制炎症因子释放并促进巨噬细胞向M2型极化,抗炎效应增强,其机制与调控巨噬细胞极化状态相关。

关键词： 细粒棘球蚴   细粒棘球蚴成纤维细胞生长因子受体1蛋白(EgFGFR1)   原核表达   多克隆抗体  

摘要： 【目的】利用原核系统表达并纯化细粒棘球蚴成纤维细胞生长因子受体1蛋白(Echinococcus granulosus FGFR1,EgFGFR1),制备多克隆抗体并定位其在幼虫及囊泡中的表达与分布,为阐明EgFGFR1的生物学功能、探索基于该蛋白的免疫诊断方法与靶向治疗策略奠定基础。【方法】构建pET30a-EgFGFR1重组质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化IPTG的浓度、诱导温度和时间,诱导重组蛋白的表达;利用SDS-PAGE分析蛋白可溶性;采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,通过Western blotting鉴定后制备多克隆抗体,分别用ELISA和Western blotting检测抗体效价及特异性,通过免疫荧光试验检测EgFGFR1在原头蚴和囊泡中的表达及定位。【结果】成功构建pET30a-EgFGFR1重组质粒,EgFGFR1重组蛋白在IPTG 0.1 mmol/L、30 ℃ 诱导5 h的条件下表达效果最佳,表观分子质量约为73 ku,以包涵体为主要表达形式,经250 mmol/L咪唑洗脱可获取大量纯化蛋白;Western blotting检测结果显示, 重组蛋白条带与预期大小一致。ELISA检测EgFGFR1多克隆抗体效价为1∶102 400;Western blotting检测结果显示,所制备的抗体可特异性识别EgFGFR1蛋白;免疫荧光检测结果显示,EgFGFR1在原头蚴及囊泡中均有表达。【结论】成功构建pET30a-EgFGFR1重组质粒,通过原核表达系统获得EgFGFR1重组蛋白,筛选出最佳诱导表达条件,实现了目的蛋白的高效纯化,并制备了具有较高特异性和免疫原性的多克隆抗体,同时检测到EgFGFR1表达于细粒棘球绦虫的原头蚴和囊泡等阶段,为后续探究EgFGFR1的生物学功能提供了试验基础。

关键词： 金纳米颗粒   核酸适配体   新冠病毒S蛋白   比色传感器   侧向流层析  

摘要： 基于ST-6-2核酸适配体与金纳米颗粒(AuNPs),构建了一种用于快速检测新冠病毒S蛋白的比色生物传感器。采用柠檬酸钠还原氯金酸法制备粒径均匀的AuNPs,通过圆二色光谱验证适配体与S蛋白的结合构象变化。比较了冷冻-解冻法、盐老化法和低pH法3种DNA与AuNPs的偶联策略,以UV-Vis光谱评估偶联效果,确定低pH法为最优方案。将巯基修饰的cDNA和Poly T共价偶联至AuNPs表面,制备显色探针(AuNPs@SH-DNA)。基于竞争性侧向流层析原理,组装试纸条,用于S蛋白的可视化检测。实验结果表明,该传感器对S蛋白具有良好的信号响应,可实现快速、低成本、便携式检测。该比色传感器平台为新冠病毒的即时检测提供了新方案,在疫情筛查和分散式诊断中具有应用潜力。

关键词： 核心岩藻糖基化   糖肽富集   质谱碎裂   质谱数据分析  

摘要： 核心岩藻糖基化是一种重要的N-糖基化修饰,其异常表达和多种癌症的发生发展密切相关,为生物标志物和药靶发现提供潜在靶点。基于质谱的糖蛋白质组学技术为全面分析核心岩藻糖修饰提供了有效的分析手段。由于核心岩藻糖基化肽段相对丰度较低、糖链结构与肽段骨架质谱碎裂行为存在差异、数据解析困难,导致核心岩藻糖修饰的大规模鉴定存在挑战。本文重点阐述了包括凝集素亲和法与化学酶法等靶向核心岩藻糖基化肽段的富集方法,详细比较了多种质谱碎裂模式,并系统介绍了数据依赖性采集和数据非依赖性采集下的质谱数据分析策略与相关软件工具。此外,还探讨了糖肽定量分析中的挑战与最新进展,以及核心岩藻糖基化在疾病生物标志物研究中的潜在价值。最后,展望了该领域在富集技术、数据分析算法和工具开发等方面的未来发展方向。

关键词： 云南灵芝   培养特性   人工栽培   农艺性状   总三萜   多糖  

摘要： 云南灵芝Ganoderma yunnanense是2022年发表的灵芝新物种,以菌盖紫褐色、菌肉洁白为典型特征,为稀有灵芝资源,在云南民间已有一定应用基础。本研究以采自哀牢山国家自然保护区的HL45菌株为材料,通过单因素结合正交试验筛选菌丝最适固体培养条件;经生产制种后开展两种覆土栽培模式对比试验,分析主要农艺性状差异;采集原基期、菌柄伸长期、成熟期3个生长阶段子实体,以高效液相色谱(HPLC)技术进行多糖及三萜类化合物的含量与组分差异分析,旨在明确云南灵芝的生长特性及活性成分积累规律。结果表明,云南灵芝菌丝生长的最适碳源为麦芽糖,最适氮源为硫酸铵,最适无机盐为七水合硫酸锌,最适pH为6.5,最适温度为26 ℃。经4年人工驯化栽培,该菌株栽培袋平均生长周期26 d,菌丝生长速度达0.78 cm/d,平均产量16.62 g/袋,生物学效率最高达到10.26%,整个栽培周期约为4–5个月。云南灵芝粗多糖含量随子实体生长成熟呈递减趋势,原基期最高为41.03 mg/g,菌柄伸长期为27.68 mg/g,成熟期含量降至16.68 mg/g;三萜类化合物含量则呈递增趋势,原基期检测出6种三萜类化合物,总含量为5 201.00 μg/g,菌柄伸长期检测出4种,总含量为25 778.80 μg/g,成熟期检测出9种三萜类化合物,总含量达到21 786.0 μg/g。本研究为云南灵芝的种质资源保护利用、规模化栽培及活性成分发掘利用提供参考依据。

关键词： 跨语言代码克隆检测   统一抽象语法树   节点类型规范化   层次化编码   多粒度相似度  

摘要： 针对跨语言代码克隆检测中语法差异导致功能等价代码难以对齐的问题,提出一种结构优先的跨语言代码克隆检测方法 SynGram(Syntactic Grammar–Driven Method)。该方法设计了用于跨语言对齐的统一抽象语法树(Unified Abstract Syntax Tree,UAST)规范化流程,通过节点类型规范化和基于分隔符的结构分解,将异构代码转换为统一的子树序列;接着构建了一个层次化编码器,该编码器融合了递归子树编码、双向门控循环单元与注意力机制,来提取代码的结构与语义特征;最后通过多粒度相似度计算来实现综合程序级与块级特征的精准判别。在覆盖六种主流语言对及Go、Rust等现代语言扩展数据集上的实验表明,SynGram的平均F1分数均达0.97以上,优于多种主流序列与图基线模型,验证了该方法在处理语法差异及实现异构代码对齐方面的有效性。

关键词： 白穗   淡绿叶   叶绿体发育   叶绿素合成   水稻  

摘要： 水稻叶片形态和颜色可通过改善群体光合效率来影响水稻产量,同时叶色发育在水稻生物和非生物逆境抗性中也发挥了重要的作用。前期,我们报道了一个叶色淡绿、颖壳白化的突变体wp4 (white panicle 4),并将调控基因精细定位在第8染色体约79 kb的物理范围内。本研究在此基础上对精细定位区间内的所有基因进行测序,发现LOC_Os08g06280/LSD1在内外显子交界处发生了G到A的碱基替换,从而导致第4内含子没有被剪切完全。随后的功能互补实验证实了LOC_Os08g06280即为WP4,在突变体中转入野生型LOC_Os08g06280基因组序列可使wp4的叶片、颖壳颜色和光合色素含量等恢复至野生型水平,表明wp4是lsd1的一个新等位突变体。生物信息学分析发现,WP4编码含3个保守锌指结构域的植物特有转录因子,与多物种同源基因高度保守。RT-qPCR结果显示,与野生型相比,突变体wp4颖壳的叶绿体发育相关基因、叶绿素合成相关基因、光合作用相关基因及类胡萝卜素合成相关基因均显著下降。因此认为,WP4可能在叶绿体发育和叶绿素合成中起重要作用,这为下一步基因调控机理研究奠定了基础,也为水稻高光效育种提供了种质资源。