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关键词： 猪轮状病毒(PoRV)   VP6蛋白   真核表达   HEK293F悬浮细胞   多克隆抗体  

摘要： 【目的】构建猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)VP6蛋白的真核表达体系,制备广谱识别能力强的多克隆抗体,为PoRV的诊断检测和基础研究提供技术支撑。【方法】基于PoRV OSU株VP6基因序列进行密码子优化并构建重组表达质粒pCAGGS-VP6-His,通过测序及双酶切鉴定后,将其瞬时转染至HEK293F悬浮细胞表达重组VP6蛋白,经Ni2+亲和层析纯化并浓缩,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组VP6蛋白多克隆抗体。间接ELISA测定抗体效价,通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)验证抗体对PoRV不同基因型毒株的免疫原性和特异性。【结果】成功扩增OSU VP6基因,大小为1 279 bp。重组表达质粒双酶切鉴定可见两条清晰的条带,与酶切载体和目的片段大小一致,成功构建重组表达质粒pCAGGS-VP6-His。VP6重组蛋白在HEK293F悬浮细胞中可溶性表达,分子质量约为45 ku。纯化浓缩后蛋白浓度高达5.23 mg/mL,总量为10.5 mg,免疫后成功制备兔抗重组VP6蛋白多克隆抗体,ELISA检测结果显示,该抗体的效价为1∶64 000。Western blotting结果显示,该多克隆抗体可特异性识别PoRV G3、G5和G9基因型病毒感染细胞中的VP6蛋白。IFA结果显示,感染组细胞胞质呈现明显的特异性荧光信号,而对照组未见明显非特异性反应,表明该抗体具有良好的特异性及多基因型识别能力。【结论】本研究成功建立PoRV VP6蛋白的真核高效表达体系,所制备的多克隆抗体具有较强的广谱识别能力,可用于PoRV的快速检测和流行病学调查,同时为VP6蛋白的功能研究奠定了基础。

关键词： 文蛤   hsf1基因   高温胁迫   表达模式   HE染色   原位杂交  

摘要： 为更好地了解文蛤(Meretrix meretrix)对高温胁迫的响应机制, 本研究克隆了文蛤hsf1(Mmhsf1)基因序列, 探究了该基因在文蛤高温应激反应中发挥的作用和分子机制。结果显示, Mmhsf1基因cDNA序列长1 869 bp, 其中开放阅读框(ORF)长1 623 bp(编码540个氨基酸), 5′非编码区(UTR)长36 bp, 3′ UTR长210 bp。预测的编码氨基酸含有HSF-DNA结合域、寡聚化结构域OD以及七价疏水重复区HR-C, 功能结构域与其他物种具有较高的相似度。荧光定量PCR显示, Mmhsf1基因在各组织中广泛表达, 其中肝胰腺和鳃中的表达量明显高于其他组织(P<0.05)。设置高温组(38 ℃)和对照组(25 ℃)开展高温胁迫实验,高温胁迫下, Mmhsf1基因随着胁迫时间的延长, 表达量逐渐上调至48 h达到峰值, 随后又逐渐下调。组织切片结果显示,高温下文蛤肝胰腺细胞中转运泡和空泡明显增多, 肝细胞排列紊乱、体积增大, 结构损伤严重。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)结果显示, 高温组Mmhsf1基因荧光杂交信号与对照组相比明显增强。同时检测了Mmhsp70基因在同等高温条件下的表达模式, Mmhsp70对热激反应敏感, 表达量急剧增加, 先于Mmhsf1达到峰值, 后持续下调。推测Mmhsf1在文蛤热应激中起到重要作用, Mmhsf1和Mmhsp70之间存在相互调控关系。本研究旨在为文蛤耐热机制和人工选育耐高温新品种提供参考资料。

关键词： 秸秆   微生物发酵   植物多糖   动物生产  

摘要： 秸秆多糖是从农作物秸秆这一农业废弃物中提取的天然活性植物多糖,具有高效安全、低残留、不易产生耐药性等优势,在畜牧养殖领域展现出广阔的应用前景。笔者系统阐述了中国秸秆资源的现状及其资源化利用面临的主要瓶颈,概述了微生物发酵秸秆生产多糖的主要工艺。文章总结了秸秆多糖在动物生产中的应用进展,包括其在促进生长、调节糖脂代谢、改善肠道健康、增强抗氧化及免疫功能等方面的作用及相关机理。未来研究应进一步深入秸秆多糖中特定单糖组分的生物学功能及其作用机制,以推动新型饲料添加剂的研发,并为秸秆多糖在养殖业中的深入应用提供理论支撑。

关键词： 睡眠呼吸暂停综合征   干细胞   细胞低氧   细胞增殖   细胞分化  

摘要： 目的 探讨低氧对颏舌肌干细胞(GG MuSCs)增殖和分化的影响及其可能机制。方法 培养1、2、6和12月龄小鼠GG MuSCs,分别作为1、2、6和12月龄组,分别应用含0μmol/L二氯化钴(CoCl2)的DMEM培养基(常氧)和含200μmol/L CoCl2的DMEM培养基(低氧)培养。采用CCK-8法检测细胞增殖活性,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell法检测细胞侵袭能力,显微镜观察各组肌管数目,免疫荧光染色法检测细胞Ki67蛋白表达,Western blot法检测细胞P21、P53和生肌分化因子D(MyoD)蛋白表达。结果 与1月龄组比较,2、6和6、12月龄组GG MuSCs增殖能力、迁移能力和侵袭能力下降(F=6.42~47.54,P<0.05);低氧处理后,各组GG MuSCs肌管形成数量和Ki67阳性率较常氧时降低(t=6.72~12.35,P<0.05)。Western blot检测显示,常氧状态下4组细胞P21、P53和MyoD蛋白表达差异有显著性(F=17.95~33.40,P<0.05),6、12月龄组MyoD蛋白表达水平较1月龄组下降(P<0.05),P53、P21蛋白表达水平较1月龄组升高(P<0.05)。低氧状态下4组细胞P21、P53和MyoD蛋白表达差异有显著性(F=17.84~24.36,P<0.05);与1月龄组比较,2、6、12月龄组MyoD蛋白表达水平均下降(P<0.05),6、12月龄组P53、P21蛋白表达水平升高(P<0.05)。析因设计方差分析显示,处理效应(常氧/低氧)与分组效应对GG MuSCs中P21、P53和MyoD蛋白表达存在交互效应(F=7.54~9.21,P<0.05)。结论低氧和老龄化可抑制GG MuSCs增殖和分化,减少肌管形成,阻碍肌肉损伤修复,其机制可能与上调P21和P53表达有关。

关键词： 菊粉   黑木耳多糖   高脂饮食   肠道菌群  

摘要： 长期高脂饮食会导致机体脂肪堆积、血脂异常、肠道菌群紊乱,增加高血脂等慢性疾病发病率。该文旨在研究菊粉复配黑木耳多糖对高脂饮食小鼠血清指标、肝脏脂肪堆积、肠道菌群的影响。首先评价了不同质量比例(5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、0∶5)菊粉复配黑木耳多糖体外降血脂活性,并将小鼠分为正常对照组(饲喂普通饲料),高脂对照组(饲喂高脂饲料),干预组饲喂添加不同比例菊粉复配黑木耳多糖的高脂饲料,干预8周后,研究高脂饮食对小鼠血清、肝脏、肠道菌群的影响。结果表明:在菊粉复配黑木耳多糖(2∶3)条件下,对甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠的结合率最高。不同比例菊粉复配黑木耳多糖对实验小鼠体重、肝体比显著降低,血清总胆固醇、总甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇含量均极显著下降,高密度脂蛋白胆固醇水平显著升高。小鼠肝脏中脂肪滴数量和体积均明显减少,均比单一菊粉、黑木耳多糖干预效果明显。菊粉复配黑木耳多糖干预高脂饮食小鼠,提高了肠道中乳酸杆菌属、杆菌属、副拟杆菌属、拟杆菌属等产生短链脂肪酸菌属相对丰度,降低了脱硫弧菌属、螺杆菌属、扭链瘤胃球菌、Colidextribacter相对丰度,改善了高脂饮食对肠道菌群的影响。该研究表明菊粉复配黑木耳多糖对高脂饮食小鼠具有调控血脂及改善肠道菌群的作用,为预防高血脂及功能性产品开发提供新思路。

关键词： 黑果枸杞   LrWRKY44   生物信息学分析   表达特性  

摘要： 以黑果枸杞的果实、根、茎、叶、花为试材,通过生物信息学工具分析了黑果枸杞LrWRKY44的结构,并通过RT-qPCR分析黑果枸杞在不同组织及不同发育时期的表达模式,以期初步探究LrWRKY44在黑果枸杞生长发育中的生物学功能。结果表明:LrWRKY44在黑果枸杞的根、茎、叶、花及果实中均有表达,其中在果实中的表达量最高。随着果实的发育,LrWRKY44的表达量逐渐增加,在成熟期达到峰值。这一表达模式与花青素含量的积累趋势相吻合。LrWRKY44可能与黑果枸杞花青素的生物合成与积累密切相关,对黑果枸杞果实色泽形成具有重要调控作用。

关键词： 卡介菌多糖核酸注射液   效力测定   IgE   方法优化   质量控制  

摘要： 目的建立一种基于酶联免疫吸附法的卡介菌多糖核酸(BCG-PSN)注射液效力测定新方法,以克服传统方法操作复杂、重复性差、主观判断性强的不足,为药品质量控制提供可靠的技术支持。方法以OVA-Al(OH)_(3)作为致敏原,比较0 d、4 d和0 d、6 d两种不同致敏程序并选择最优者。采用最优的致敏程序,比较3批BCG-PSN注射液在两种治疗方案中的治疗效果,选择最优的治疗方案,并进行方法确认及多批次制品确认。同时将该品种优化后的效力检测方法与现行药典效力检测方法进行比对。结果0 d、6 d致敏程序治疗后,2批试验组血清IgE水平相对模型对照组均有显著性差异(P<0.05),而0 d、4 d组仅1批试验组有显著性差异,说明0 d、6 d致敏程序更适合用于BCG-PSN的效力评价。治疗方案一(1 mL/只,隔天1次,治疗10次)和治疗方案二(2 mL/只,3天1次,治疗5次)治疗后3组的血清总IgE水平均低于模型对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);方案一的IgE水平下降比例分别为50.7%、45.3%、38.7%,方案二的IgE水平下降比例分别为51.3%、42.3%、41.1%,两种治疗方案IgE下降比例基本一致,鉴于试验中动物接受治疗的次数,宜选用治疗次数更少的方案二接受度更好。通过与现行药典对比,BCG-PSN注射液优化后的效力检测方法显著提高了灵敏度和重复性,且具有良好的适用性和精密度,多批次制品测定结果稳定。结论建立的基于酶联免疫吸附法测定BCG-PSN注射液效力的方法可靠、高效,对保证药品质量具有重要意义。

关键词： 来特莫韦   异基因造血干细胞移植   淋巴细胞亚群   流式细胞术  

摘要： 目的探讨来特莫韦(LTV)预防异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)后巨细胞病毒(CMV)感染及其免疫重建特征。方法回顾性研究2021年4月至2024年12月北京陆道培医院收治的148例allo-HSCT血液系统恶性肿瘤患者的临床资料,根据是否应用LTV预防治疗分为非LTV组67例和LTV组81例。采用流式细胞术检测患者移植前、移植后每月时间点外周血淋巴细胞亚群。结果LTV组患者移植后180d内临床显著的CMV感染(CS-CMVi)发生率明显降低,CMV激活时间更晚,感染持续时间更短,差异均有统计学意义(P<0.01),两组病毒中位载量及CMV疾病发生率差异无统计学意义(P>0.05)。临床显著的EB病毒感染(CS-EBVi)发生率偏高(14.9%vs.27.2%,P=0.083),但感染持续时间偏短(26dvs.18d,P=0.179),中位载量更低(1850拷贝vs.1600拷贝,P=0.984),EBV相关移植后淋巴增殖性疾病(EBV-PTLD)发生率无明显增高(2.99%vs.2.47%,P=0.847)。患者移植后180d内降低CS-CMVi的独立因素为应用LTV预防(HR=0.16,95%CI 0.08~0.35,P<0.001),增加CS-EBVi的独立危险因素为采用兔抗人胸腺细胞免疫球蛋白(rATG)预防移植物抗宿主病(GVHD)(HR=2.50,95%CI 1.04~6.06,P=0.042)及LTV的应用(HR=2.63,95%CI 1.02~6.77,P=0.046)。两组患者移植前外周血总淋巴细胞、T淋巴细胞(CD3^(+)T)、辅助性T细胞(CD4^(+)T)、细胞毒性T细胞(CD8^(+)T)、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)T细胞计数,差异均无统计学意义(P>0.05)。LTV组NK T细胞计数偏低(38 vs.25,P=0.004),CD4^(+)Treg细胞计数偏高(8 vs.17,P=0.018)。移植后6个月内LTV组外周血总淋巴细胞、CD3^(+)T、CD8^(+)T、NK T细胞计数及比例,CD4^(+)T细胞绝对计数、NK T细胞比例明显低于非LTV组,B淋巴细胞比例多时间点高于非LTV组,差异均有统计学意义(P<0.05);6个月停用LTV后,以上各亚群结果差异均无统计学意义(P>0.05)。LTV组调节性T细胞占CD4^(+)T细胞比例、CD4/CD8比值高(P<0.05),CD4及CD8阳性初始T细胞、中央记忆T细胞、CD8^(+)终末分化记忆T细胞比例显著升高(P<0.05),CD4及CD8阳性效应记忆T细胞比例显著减低(P<0.05)。结论应用LTV预防HSCT后巨细胞病毒感染,其免疫重建虽在早期T细胞数量略低,但T细胞功能与储备得到保护,更利于后期免疫重建的恢复。

关键词： 平菇   液态发酵   平菇多糖   抗氧化活性   氧化损伤  

摘要： 为研究平菇液态发酵胞外多糖(POFP)、平菇菌丝体多糖(POMP)和平菇子实体多糖(POP)的抗氧化活性差异,本研究采用食用菌液态发酵、多糖分离纯化等技术制备了POFP和POMP,并与POP进行抗氧化活性对比评价。研究采用DPPH自由基、ABTS^(+)自由基、OH自由基清除能力和总还原力评价三种多糖的体外抗氧化活性,并采用紫外线氧化损伤和H_(2)O_(2)氧化损伤酵母细胞模型来评估其氧化损伤防护作用。结果表明:三种多糖均由两种不同分子量的组分构成,分子量在375.31~9788.14 Da之间,大小排序为POP>POMP>POFP;三种多糖对DPPH、ABTS^(+)、OH自由基均有较好的清除能力,并且具有良好的还原能力,且呈现剂量依赖性。其中POFP的总还原力最强,在5 mg/mL时OD700值可达0.51±0.04,高于POMP和POP。此外,三种多糖均可显著提高紫外线和H_(2)O_(2)氧化损伤酵母细胞存活率;POP防护效果较强,在25 mg/mL时可使紫外线损伤酵母细胞活力恢复至96.05%±4.02%,在15 mg/mL可使H_(2)O_(2)氧化损伤酵母细胞活力恢复至91.60%±3.26%,与VC处理组效果相当。综上所述,不同来源的平菇多糖均具有良好的抗氧化活性,液态发酵技术为新型抗氧化天然产物的制备提供了新路径。

关键词： 青稞   Hinb-1基因   籽粒硬度   克隆   表达分析  

摘要： 为获得青稞籽粒硬度相关基因HvHinb-1的优异基因型,选取硬度差异显著的青稞品种苏马(硬度值:14.66±1.55)和南木林(硬度值:21.42±1.83),通过PCR克隆并测序获得HvHinb-1基因序列,分析不同基因型序列特征、蛋白理化性质及表达模式;分析HvHinb-1在21份硬度不同的青稞品种的分布及基因型,并利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测HvHinb-1在籽粒发育不同阶段(乳熟早期、中期和晚期)的表达量。结果表明,从青稞品种苏马和南木林中均可克隆到HvHinb-1基因,其编码蛋白序列一致性为98.64%,存在2个氨基酸差异。HvHinb-1为亲水性碱性蛋白,等电点8.69,分子量16.12~16.14 kDa,二级结构组成以α-螺旋和无规卷曲为主。经系统进化分析,青稞与大麦HvHinb-1亲缘关系最近。在12份硬度较小(硬度:9.04~15.04)青稞材料中,HvHinb-1的氨基酸序列在第78和94处为H,9份硬度较大(硬度:18.93~22.76)青稞材料中,其氨基酸序列在第78和94处为Q。通过qRT-PCR分析,在乳熟早期籽粒中,HvHinb-1在苏马中的表达量显著高于南木林,而在乳熟中期,在南木林中表达量极显著高于苏马,说明该时期可能是籽粒硬度形成的关键阶段。