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关键词： 金线莲   黄酮醇合酶   基因克隆   亚细胞定位   胁迫响应  

摘要： 金线莲(Anoectochilus roxburghii)作为名贵中药材,其核心药用成分黄酮醇的生物合成机制尚未完全阐明。黄酮醇合酶(FLS)是该途径的关键限速酶,其功能在金线莲中缺乏研究。为解析在黄酮合成及逆境响应中ArFLS基因的作用,本研究基于金线莲全长转录组数据,克隆了ArFLS基因,其开放阅读框(ORF)全长为1 032 bp,编码344个氨基酸。生物信息学分析表明,ArFLS蛋白分子量为38.87 kDa,理论等电点(pI)为5.37,属稳定的亲水性蛋白,并具有典型的2-氧戊二酸依赖型双加氧酶(2-ODD)保守结构域。系统进化分析显示,ArFLS与兰科多花兰(Cymbidium floribundum)和铁皮石斛(Dendrobium officinale)的FLS蛋白聚为单子叶植物分支,同源性达74%以上。亚细胞定位结果表明,ArFLS同时定位于细胞核与细胞质。组织特异性表达分析显示,ArFLS在金线莲花中表达量极显著高于根、茎、叶(分别为叶的5.95倍、茎的5.50倍和根的2.17倍),且其表达受温度和盐胁迫显著调控,即35℃时表达量最高,低温抑制表达;100 mmol·L^(-1)NaCl处理下表达量提升至对照的2.28倍。原核表达与蛋白免疫印迹(Western blot)验证证实,ArFLS基因可在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步解析ArFLS基因功能和阐述金线莲黄酮醇合成机制奠定了基础。

关键词： 心血管疾病   类器官   干细胞   疾病建模  

摘要： 心血管疾病是当前全球发病率和死亡率最高的疾病,但其发病机制研究和药物开发仍面临重大挑战,部分归因于传统研究模型的局限性。二维(2D)细胞培养难以模拟体内微环境,而动物模型存在物种差异,无法完全重现人类心血管系统的生理和病理特征。近年来,干细胞技术不断突破,类器官模型研究迅速发展,为心血管机制研究和药物研发提供了创新工具。心血管类器官是由干细胞在体外三维(3D)培养条件下构建的微组织模型,可高度模拟人体心脏和血管的结构、组成及功能,显著提升研究的生理相关性。本文系统综述了其构建策略、应用进展,并探讨了当前局限与未来方向。

关键词： 股骨头坏死   骨髓间充质干细胞   信号通路   脂肪因子   脂肪细胞   骨髓微环境   分化平衡   干细胞疗法  

摘要： 背景:股骨头坏死是一种常见的骨科疾病,其致残率高,临床特征为股骨头塌陷,导致严重髋关节疼痛和功能丧失。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能,其分化方向包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。在酒精、皮质激素等病理刺激下,成骨和成脂分化之间的动态均衡被破坏,可引起脂肪细胞的异常积累和骨形成的减少,最终导致股骨头坏死。目的:重点解析股骨头坏死的分子机制,特别关注骨髓间充质干细胞的核心作用,并深入探讨脂肪细胞对疾病发展进程的影响。方法:检索PubMed数据库,检索词“osteonecrosis of the femoral head,bone marrow mesenchymal stem cells,osteogenic differentiation,adipogenic differentiation,bone marrow adipose tissue,adipokines”,检索时限从建库至2025年6月。根据纳入与排除标准,最终纳入81文献进行综述。结果与结论:汇总研究后发现,Wnt、转化生长因子β/骨形态发生蛋白超家族、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B等信号通路,联合多种RNA分子,共同调控骨髓间充质干细胞的成骨/脂分化平衡。各信号通路通过靶向关键转录因子,如成骨相关的Runt相关转录因子2,成脂相关的过氧化物酶体增殖物激活受体γ及CCAAT增强子结合蛋白,从而实现对细胞行为的精确调控。此外,脂肪细胞及其分泌的细胞因子,如瘦素和脂联素等,亦可通过旁分泌作用影响股骨头坏死的发展进程。文章通过聚焦骨髓间充质干细胞和脂肪细胞的相互作用阐述了股骨头坏死的发病机制,并在当前研究进展的基础上展望了未来干预方向和治疗策略。

关键词： 黄芪多糖(APS)   氧糖剥夺/复氧模型   BV2小胶质细胞   脂多糖(LPS)   Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路  

摘要： 目的:探讨黄芪多糖(APS)调节Toll样受体4(TLR4)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R)中BV2小胶质细胞极化的影响。方法:建立BV2小胶质细胞的OGD/R损伤模型,分为空白组、OGD/R组与APS组(0.4 g·L^(-1) APS);脂多糖(LPS)诱导神经炎症损伤,予以APS干预,分为空白组、LPS组(1 mg·L^(-1) LPS)与APS组(0.4 g·L^(-1) APS^(+)1 mg·L^(-1) LPS)。使用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法检测细胞活力;倒置显微镜观察细胞形态;格里斯硝酸盐检测法(Griess)检测细胞上清中一氧化氮(NO)含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-10、IL-4的分泌水平;免疫荧光法(IF)检测钙离子结合接头蛋白分子-1/诱导型一氧化氮合酶(Iba-1^(+)/iNOS^(+))和钙离子结合接头蛋白分子-1/精氨酸酶1(Iba-1^(+)/Arg1^(+))的双阳性率及核转录因子-κB p65(NF-κB p65)的入核率;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Iba-1、iNOS、Arg1、TLR4、NF-κB p65蛋白表达水平。结果:OGD/R损伤模型中,与空白组比较,OGD/R组的BV2小胶质细胞活化并呈现阿米巴样改变,NO、TNF-α、IL-6分泌水平显著提高(P<0.01),Iba-1^(+)/iNOS^(+)双阳性表达率、Iba-1、iNOS蛋白表达显著提高(P<0.01),NF-κB p65入核率、TLR4、NF-κB p65蛋白表达显著升高(P<0.01),IL-10和IL-4含量显著下降(P<0.01),Iba-1^(+)/Arg1^(+)双阳性表达率、Arg1蛋白表达显著降低(P<0.01);与OGD/R比较,APS组(0.4 g·L^(-1))细胞活化减少,NO、TNF-α、IL-6分泌水平显著下降(P<0.01),Iba-1^(+)/iNOS^(+)双阳性表达率、Iba-1、iNOS相对蛋白表达显著降低(P<0.01),NF-κB p65入核率、TLR4、NF-κB p65蛋白表达显著下降(P<0.01),IL-10和IL-4含量显著提高(P<0.01),Iba-1^(+)/Arg1^(+)双阳性表达率、Arg1蛋白表达显著增加(P<0.01)。在LPS诱导的神经炎症模型中,与空白组比较,LPS组细胞活化增加,NO、TNF-α、IL-6含量、Iba-1^(+)/iNOS^(+)双阳性表达率、NF-κB p65入核率、Iba-1、iNOS、TLR4、NF-κB p65蛋白表达显著提高(P<0.01),IL-10和IL-4水平、Iba-1^(+)/Arg1^(+)双阳性表达率、Arg1蛋白表达显著下降(P<0.01);与LPS组比较,APS组细胞活化减少,NO、TNF-α、IL-6含量、Iba-1^(+)/iNOS^(+)双阳性表达率、NF-κB p65入核率、Iba-1、iNOS、TLR4、NF-κB p65蛋白表达显著降低(P<0.01),IL-10和IL-4水平、Iba-1^(+)/Arg1^(+)双阳性表达率、Arg1蛋白表达显著升高(P<0.01)。结论:APS可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路激活,减少小胶质细胞的活化并促进其向M2型极化,从而减轻OGD/R后产生的神经炎症反应。

关键词： 聚二甲基硅氧烷   硬度   骨髓基质干细胞   增殖   YAP蛋白   初级纤毛   β-catenin   Wnt通路   细胞外基质  

摘要： 背景:组织工程支架的物理特性可直接影响种子细胞活性及修复效果,其中细胞外基质硬度是影响种子细胞增殖活性的关键因素,初级纤毛和YAP蛋白作为经典的力学感受器及下游转导因子,可能直接介导了这一机制。目的:探讨细胞外基质硬度对骨髓基质干细胞增殖活性的调控作用及相关机制。方法:骨髓基质干细胞传代后接种于不同硬度(软、中度、硬)的聚二甲基硅氧烷基底膜进行培养,CCK-8测定细胞增殖活性,qRT-PCR检测增殖基因c-myc和CCND1的转录活性,Western blot检测Wnt/β-catenin通路激活情况,通过乙酰化α-tubulin及YAP免疫荧光染色评估初级纤毛及YAP蛋白表达。骨髓基质干细胞传代后接种于不同硬度(软、硬)的聚二甲基硅氧烷基底膜进行培养,然后使用siRNA干扰YAP蛋白表达,Western blot检测YAP、磷酸化GSK-3β、β-catenin蛋白表达,qRT-PCR检测c-myc和CCND1的转录活性,乙酰化α-tubulin免疫荧光染色分析初级纤毛长度。结果与结论:硬性聚二甲基硅氧烷条件下的细胞增殖活性、c-myc和CCND1的转录活性显著高于软性、中等硬度聚二甲基硅氧烷,且Wnt/β-catenin通路激活程度强于软性、中等硬度聚二甲基硅氧烷;免疫荧光染色结果显示,硬性聚二甲基硅氧烷诱导了初级纤毛缩短和YAP蛋白阳性细胞增多。通过siRNA干扰YAP蛋白表达后,YAP、磷酸化GSK-3β、β-catenin蛋白表达以及c-myc和CCND1转录活性的组间差异性消失,伴随初级纤毛长度差异消失。结果表明,细胞外基质硬度通过YAP蛋白/初级纤毛新机制,直接调控骨髓基质干细胞的增殖活性。

关键词： 双膦酸盐   颌骨骨坏死   唑来膦酸   颌骨   拔牙窝   间充质干细胞   增殖   迁移   成骨分化  

摘要： 背景:双膦酸盐类药物作为抗骨吸收治疗的核心药物,广泛应用于代谢性骨病的治疗,然而长期使用会引发双膦酸盐相关性颌骨坏死并发症。传统发病机制聚焦于双膦酸盐类药物对破骨细胞的抑制作用,但难以完全解释骨坏死病理发展过程,而与相对成熟的破骨细胞研究相比,双膦酸盐类药物对成骨相关细胞生物学特性及功能影响的报道较少,且部分报道之间存在差异,这种差异性可能源于实验体系、药物浓度及细胞来源,凸显了开展系统性、标准化研究的必要性。目的:探讨临床常用第3代双膦酸盐——唑来膦酸对小鼠拔牙窝愈合及颌骨来源骨髓间充质干细胞增殖、迁移和成骨分化的影响。方法:将16只雄性C57B/6J小鼠随机平均分为对照组和实验组,实验组腹腔注射唑来膦酸联合皮下注射地塞米松,对照组注射等量PBS,注射2周后拔除所有小鼠左侧上颌第一磨牙,继续注射2周后处死取材。通过拔牙窝创口大体观察、Micro CT成像与三维重建分析、苏木精-伊红染色观察小鼠拔牙窝骨改建、黏膜愈合情况;分离和培养两组小鼠下颌骨来源骨髓间充质干细胞,进行正常培养和成骨诱导培养后,通过CCK-8法、qPCR、Westernblot以及碱性磷酸酶染色、茜素红染色,观察唑来膦酸对细胞增殖、迁移及成骨分化的影响。结果与结论:①相比于对照组,实验组小鼠拔牙窝骨与黏膜愈合不良,炎性细胞浸润更明显;②相比于对照组,实验组小鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞的增殖、迁移能力明显受到抑制(P<0.05);③相比于对照组,实验组小鼠颌骨来源骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色较弱,钙结节数量减少,成骨相关标志物碱性磷酸酶、整合素结合唾液酸蛋白、Ⅰ型胶原α1链、Runt相关转录因子2表达下调(P<0.05)。结果表明:唑来膦酸可对小鼠拔牙窝愈合造成不良影响,可能与抑制颌骨来源骨髓间充质干细胞增殖、迁移、成骨分化有关。

关键词： 脂肪干细胞   还原型氧化石墨烯   绿色合成工艺   内皮向分化   血管生成   组织工程血管化  

摘要： 背景:脂肪干细胞能够在特定的诱导环境下分化为血管内皮细胞,是组织工程血管化过程中较为理想的种子细胞。然而脂肪干细胞的内皮向分化效率低,严重限制了该方法的应用。目的:探讨还原型氧化石墨烯对脂肪干细胞内皮向分化效率和血管形成能力的影响。方法:首先,采用绿色合成工艺制备还原型氧化石墨烯,使用透射电镜、能谱分析和傅里叶变换红外光谱等手段对还原型氧化石墨烯进行材料表征。然后将不同质量浓度的还原型氧化石墨烯与脂肪干细胞共培养,通过CCK-8实验确定还原型氧化石墨烯的安全浓度范围,接着利用安全浓度范围内的还原型氧化石墨烯诱导脂肪干细胞内皮向分化,通过RT-qPCR和Western blot检测脂肪干细胞内皮向分化相关指标的表达。最后,通过划痕实验和小管形成实验评估还原型氧化石墨烯诱导分化后细胞的成管和迁移能力。结果与结论:①还原型氧化石墨烯具有典型的二维片状结构,主要含碳、氧元素,可检测到与含氧官能团相关的特征吸收峰;②CCK-8实验结果显示,10μg/mL及以下浓度的还原型氧化石墨烯培养72 h对脂肪干细胞的活力无影响;③RT-qPCR和Western blot结果显示,10μg/mL及以下浓度的还原型氧化石墨烯诱导6,9 d均可以显著提高脂肪干细胞内皮向分化相关标志物的表达,其中5μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9 d,内皮向分化标志物基因表达差异最大;④划痕实验和小管形成实验结果表明,相较于空白组和对照组,还原型氧化石墨烯组细胞的迁移和成管能力显著增强;⑤结果表明,绿色合成的还原型氧化石墨烯可以显著提高脂肪干细胞的内皮向分化效率,其中5μg/mL还原型氧化石墨烯诱导9d是最佳的时间浓度组合,诱导分化后的细胞具有更好的血管形成功能。

关键词： 骨关节炎   外泌体   鹿茸干细胞   microRNA   miRNA-145   软骨细胞   SOX9   转化生长因子β1(TGF-β1)   SMAD3  

摘要： 背景:近年来,干细胞外泌体对关节炎的治疗作用备受关注,课题组前期已发现鹿茸干细胞外泌体对软骨缺损有明显修复作用,但其作用机制尚不清楚。目的:探究鹿茸干细胞外泌体中miRNA-145在关节炎软骨细胞中的调控作用和机制。方法:通过慢病毒载体系统构建过表达miRNA-145的鹿茸干细胞,并通过超速离心法提取外泌体。将大鼠软骨细胞分为5组:空白对照组、白细胞介素1β组、外泌体+白细胞介素1β组、空载体转染外泌体+白细胞介素1β组、miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组,除空白对照组外,其余4组用白细胞介素1β诱导软骨细胞24 h建立炎症细胞模型,然后分别用相应外泌体处理,采用CCK-8检测细胞增殖水平,划痕实验检测细胞迁移能力,qPCR、Western blot实验检测软骨细胞相关基因和蛋白表达水平。结果与结论:①外泌体呈现典型椭圆形双层囊泡样结构,直径在50-150 nm之间,均表达外泌体的经典标志物CD9、ALIX和TSG101,且不表达Calnexin;②鹿茸干细胞外泌体可提高炎症环境下软骨细胞活力、细胞迁移率、Ⅱ型胶原A1、转化生长因子β1、SMAD3、SOX9 mRNA和蛋白表达水平,降低基质金属蛋白酶13 mRNA表达水平;③miRNA-145过表达使炎症环境下软骨细胞活力、细胞迁移率、Ⅱ型胶原A1、转化生长因子β1、SMAD3、SOX9 mRNA和蛋白表达下降,基质金属蛋白酶13 mRNA表达上升;④结果表明,鹿茸干细胞外泌体可以通过转化生长因子β1/SMAD3信号通路促进软骨细胞修复,miRNA-145过表达后抑制软骨细胞修复。

关键词： 黄精多糖   阿尔茨海默病   认知功能障碍   激素受体α(ERα)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路  

摘要： 目的:观察黄精多糖(PRP)改善去卵巢(OVX)-阿尔茨海默病(AD)模型大鼠认知和情绪功能障碍的有效性及其机制。方法:将60只SPF雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、雌二醇组(灌胃,0.18 mg·kg^(-1)·d^(-1))、PRP低剂量组(灌胃,200 mg·kg^(-1))、PRP中剂量组(灌胃,400 mg·kg^(-1))和PRP高剂量(灌胃,800 mg·kg^(-1))组;进行OVX手术,术后1周行阴道涂片检测并腹腔注射D-半乳糖(150 mg·kg^(-1)·d^(-1),1次/d,持续8周)构建OVX-AD模型;术后9周进行药物干预(1次/d,持续4周)。疗程结束后,通过旷场实验、新物体识别实验、Morris水迷宫实验和透射电镜切片评估大鼠的认知、情绪功能和海马CA3区损伤状况;通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)和生化法检测炎症[白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)]和氧化应激[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]指标;通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测雌激素受体α(ERα)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路,细胞凋亡[B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)]和病理性沉积蛋白指标[神经细胞外β淀粉样蛋白1-42(Aβ_(1-42))、微管相关蛋白(Tau)、微管相关蛋白磷酸化位点404[p-Tau(Ser404)]的mRNA和蛋白表达水平。结果:与空白组大鼠比较,模型组大鼠表现出明显的海马CA3区神经元超微结构损伤及中心区域活动时间和穿梭次数减少,新物体识别指数和探索次数下降,潜伏期延长、目标象限活动时间和穿越平台次数减少(P<0.05,P<0.01),并可测得IL-6、TNF-α、IL-1β、Bax、Aβ_(1-42)、Tau、磷酸化(p)-Tau(Ser404)的含量和表达水平明显升高及SOD、GSH-Px、ERα、PI3K、Akt、Bcl-2的活性和表达水平明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组大鼠比较,雌二醇和PRP各剂量组大鼠则表现出明显的神经元损伤缓解及中心区域活动时间和穿梭次数增加,新物体识别指数和探索次数升高,潜伏期缩短、目标象限活动时间和穿越平台次数增加(P<0.05,P<0.01),并可测得IL-6、TNF-α、IL-1β、Bax、Aβ_(1-42)、Tau、p-Tau(Ser404)的含量和表达水平明显降低及SOD、GSH-Px、ERα、PI3K、Akt、Bcl-2的活性和表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01)。结论:PRP可改善OVX-AD模型大鼠的认知和情绪功能,其机制可能与调控ERα/PI3K/Akt信号通路及抑制Aβ、Tau、神经炎症、氧化应激和细胞凋亡进而缓解神经元损伤有关。

关键词： 蛋白质组学   结直肠腺瘤   结直肠癌   生物标志物  

摘要： 目的:探索结直肠肿瘤良恶性鉴别的潜在标志物,探究结直肠肿瘤恶性转化的可能机制及相关信号通路。方法:纳入30例健康对照、30例结直肠腺瘤及30例结直肠癌患者的血清样本,进行4D-DIA质谱数据采集。以差异表达倍数>1.2或<0.833,且P<0.05筛选结直肠腺瘤和结直肠癌的差异蛋白。对上调和下调差异表达倍数前5位蛋白质进行STRING数据库分析;对差异蛋白进行GO富集分析、KEGG富集分析、GSEA富集分析。同期纳入16例结直肠腺瘤、16例结直肠癌患者的血清样本,采用ELISA检测人触珠蛋白(haptoglobin, HP)表达水平;ROC曲线分析HP对腺瘤和腺癌的鉴别潜力。结果:共筛选出76个上调差异蛋白和72个下调差异蛋白,其中上调前5位蛋白为HP、CRP、PIGR、CHI3L1、SERPINA1,下调前5位为SELE、POMGNT1、SOD1、RAB27B、ANXA11。蛋白互作网络主要以HP、CRP、PIGR、CHI3L1、SERPINA1、SELE为核心蛋白。其中HP鉴别腺瘤和腺癌的AUC为0.912,与CEA联合的鉴别效能优于CEA联合CA19-9。GO富集结果显示,差异蛋白在细胞外区域、抗原结合、免疫反应等方面显著富集;KEGG富集结果显示,差异蛋白在补体和凝血级联反应、PI3K-Akt等通路显著富集;GSEA富集结果显示,差异蛋白富集在凋亡、mTORC1信号通路等生物学途径。结论:血清HP可能作为结直肠肿瘤良恶性鉴别的潜在标志物,其与CEA联用可提升诊断效能。免疫反应、补体和凝血级联反应、凋亡等生物功能和多条信号通路在结直肠肿瘤恶性转化进程中发挥重要作用。