关键词:
肝移植
骨髓间充质干细胞
肝细胞生长因子
肝纤维化
摘要:
目的探讨肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)在肝移植术后肝纤维化中的作用。方法将78只SPF级雄性SD大鼠, 除假手术组(Sham组)按随机数字表法选取6只大鼠外, 余组每组12只, 按照随机数表法随机分为6只供者大鼠和受者大鼠。具体包括:肝移植组(LT组)、肝移植后注射原代BMSC组(LT+BMSC组)、肝移植后注射仅有空载病毒转染的BMSC组(LT+BMSC-HGF-组)、肝移植后注射HGF修饰的BMSC组(LT+BMSC-HGF+组)以及肝移植后注射HGF修饰的BMSC并在术后7 d和14 d分别进行肝脏冰冻切片的LT+BMSC-HGF+(7 d)组和LT+BMSC-HGF+(14 d)组。使用自动生化分析仪测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBil)水平;采用苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)染色和免疫组织化学染色观察肝脏炎症、纤维化和结构变化, 用Metavir纤维化分期对纤维化程度进行评估。将大鼠肝星状细胞系(T6)和肝细胞系(IAR20)按照处理方式不同分为T6正常培养组和IAR20正常培养组(T6组和IAR20组)、T6缺氧-复氧组和IAR20缺氧-复氧组(T6+IR组和IAR20+IR组)、T6缺氧-复氧后与原代BMSC共培养和IAR20缺氧-复氧后与原代BMSC共培养组(T6+IR+BMSC组和IAR20+IR+BMSC组)、T6缺氧-复氧后与HGF修饰的BMSC共培养组和IAR20缺氧-复氧后与HGF修饰的BMSC共培养组(T6+IR+BMSC-HGF+组和IAR20+IR+BMSC-HGF+组)。使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(WB)检测肝组织和贴壁细胞中的ACTA2、CASP3、COL1A1、HGF、IL7、IL7R、JAK1、STAT5、p-STAT5和TGFB1的RNA和蛋白表达。使用5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)染色法检测IAR20缺氧-复氧再与原代BMSC共培养后即时[IAR20+IR+BMSC(0 h)组]、共培养6 h[IAR20+IR+BMSC(6 h)组]时IAR20的增殖能力, 以及IAR20缺氧-复氧再与HGF修饰的BMSC共培养6 h [IAR20+IR+BMSC-HGF+(6 h)组]时的IAR20增殖能力。使用流式细胞术检测IAR20组、IAR20+IR组、IAR20+IR+BMSC组和IAR20+IR+BMSC-HGF+组的IAR20凋亡情况。结果门静脉单次注射5×106个HGF修饰的BMSC可在大鼠体内存活14 d以上。HE染色、马松染色和ACTA2染色显示, LT+BMSC组和LT+BMSC-HGF-组大鼠肝脏的肝小叶结构、细胞外基质沉积、纤维结缔组织以及炎症细胞浸润均无明显差异。WB检测显示, LT+BMSC组和LT+BMSC-HGF-组大鼠肝组织COL1A1、HGF和ACTA2的RNA和蛋白表达也无明显差异。HE染色显示, LT+BMSC-HGF+组和LT组分别与LT+BMSC组相比, 大鼠肝脏肝小叶结构紊乱、细胞外基质沉积、纤维结缔组织增生以及炎症细胞浸润更少和更轻。Sham组、LT组、LT+BMSC组和LT+BMSC-HGF+组马松染色面积分别为1.6%±0.3%、27.5%±2.7%、8.1%±0.9%和2.1%±0.9%, ACTA2染色面积分别为3.2%±0.5%、13.6%±1.8%、6.6%±0.4%和2.8±0.6%, TUNEL染色面积分别为0.6%±0.3%、7.9%±1.0%、2.7%±0.5%和1.1%±0.3%, Metavir纤维化分期分别为F0、F2.2±0.4、F1.2±0.4和F0.7±0.5。LT+BMSC-HGF+组马松染色面积、ACTA2染色面积和Metavir纤维化分期均较LT+BMSC组降低, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。Sham组、LT组、LT+BMSC组和LT+BMSC-HGF+组大鼠术后1个月ALT和AST分别为(18.65±5.523)U/L、(55.00±9.77)U/L、(40.38±8.02)U/L、(36.17±4.93)U/L和(18.02±3.32)U/L、(52.07±11.11)U/L、(40.63±5.68)U/L、(38.13±7.01)U/L。LT+BMSC组和Sham组与LT组比较, 差异有统计学意义(均P<0.05)。LT+BMSC-HGF+组大鼠肝脏中Col1a1、Jak1、Il7r、Tgfb1、Acta2、Casp3和Il7的RNA表达均较LT+BM