关键词:
家蚕
代谢组学
蛋白质组学
甘氨酸
甘氨酸转运蛋白基因
摘要:
家蚕(Bombyx mori)是完全变态的鳞翅目昆虫,一生经历卵、幼虫、蛹和蛾四个在形态结构和机能上完全不同的发育阶段。其中, 幼虫期是家蚕摄取食物进行生长的阶段,所汲取的营养物质除了完成个体的生长外,还在幼虫末期用来合成丝蛋白以形成蚕茧,同时为蛹体的构建储备营养物质;家蚕幼虫生民到合适的大小,遂开始吐丝结茧,并在茧层内完成幼虫向蛹的转变。蛹期是幼虫过渡到成虫的变态阶段,为生殖系统的发育和成虫器官的形成提供关键支持。毫无疑问,蚕蛹对于家蚕的繁衍至关重要,而茧层则主要保护蚕蛹免遭自然环境危害、微生物感染和天敌猎食,同时可以用来生产具有重要经济价值的蚕丝。一个蚕茧的茧层和蚕蛹的重量通常是平衡的,如果茧层太少,不利于蚕蛹保护;而蚕蛹太小,又不利于生殖。正因为如此精妙的进化,家蚕在地球上才能生存至今。茧层和蚕蛹的平衡关系通常用茧层率来反映,该指标是指茧层重占茧重的百分比。目前,生产上使用的家蚕,其茧层率分布范围大概在10%到30%之间。尽管杂交选育可以使该性状得到一定程度的优化,但是很难突破30%。究其原因有以下几个方面:茧层率性状受到遗传调控,其遗传稳定性受环境影响较小,而受品种的影响相对较大;茧层重与蛹体重之问具有高度正相关性,相关系数为0.85;家蚕吸收的干物质用于形成茧层和构建蛹体的比例约为1:1。这些证据表明,家蚕在长期进化过程中形成一种精密的调控机制,以确保家蚕用于合成茧层和构建蛹体的营养物质处于动态平衡状态。家蚕丝-蛹营养平衡是其为了生存的生物学行为,是其长期进化过程中有趣的生物学现象,对其调控机制的研究可为生产上人为操控家蚕分配更多的营养物质形成蚕丝提供切入点。鉴于此,本研究选择了三组家蚕丝-蛹营养失衡的生物材料,即突变体裸蛹、摘除丝腺和敲除丝蛋白基因的家蚕,结合代谢组学和蛋白质组学技术,系统比较分析所选材料的代谢物差异以及代谢通路中关键酶的变化,筛选影响丝-蛹营养平衡的代谢通路和关键调控基因,进-步开展生物学功能验证。获得的主要研究结果如下:1.家蚕丝-蛹营养物质失衡自然突变体血淋巴的代谢组学我们首先调查了7个家蚕品种的茧层率,它们之间的茧重相差较大,除裸蛹外,其余品种的茧层率均在10%到30%之间。而裸蛹因其后部丝腺严重退化,导致其合成的丝蛋白量显著降低。因此,本研究选择裸蛹(Nd)作为反证材料,同时选择Dazao和21-872作为对照(为了描述方便将它们命为Nd组),探究家蚕丝-蛹营养平衡的调控机制。首先测定Nd组生化指标,结果显示五龄第3天,Nd血淋巴中海藻糖含量较高,脂肪体中糖原和ATP含量较高,三酰甘油含量较低。本研究建立了一套家蚕血淋巴的“全组分”非靶向代谢组学分析方法。运用该方法对Nd组血淋巴进行检测,最终获得100个结构被鉴定的化合物,并对其中的82个化合物进行了标准品验证。对五龄第3天到第6天Nd组血淋巴代谢特征的主成分分析发现,Nd与Dazao或21-872具有明显的分离趋势,两个对照之间没有分离趋势。这一结果说明,Nd血淋巴中有与对照存在差异的代谢物。将五龄第6天的Nd与Dazao进行比较,获得46个化合物结构被鉴定的差异代谢物。其中有15个代谢物在Nd血淋巴中含量高于Dazao,主要包括尿酸、甘氨酸、氨基丙二酸、丝氨酸、脯氨酸、羊毛硫氨酸、乙醇酸和谷氨酸等,特别是尿酸和甘氨酸在Nd中的富集尤为明显。Nd血淋巴中含量低于Dazao的代谢物有31个,主要包括糖类(肌醇、来苏糖、2-酮基-葡糖酸)、三羧酸TCA循环(柠檬酸、苹果酸、延胡索酸,)的中间代谢物、脂类及脂代谢途径(甘油酸、胆固醇、十八酸、甘油、亚麻酸)和氨基酸等(甲硫氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、羟脯氨酸)。2.人为阻碍丝蛋白合成导致家蚕丝-蛹营养失衡的代谢组学研究敲除家蚕丝素重链基因Bmfib-H (Bmfib-H gene knock-out, FGKO)、摘除家蚕丝腺(Silk glands extirpation, SGE)都能够阻碍丝蛋白的合成,导致丝产量急剧降低、蛹体重显著增加。为了描述方便将Bmfib-H基因敲除品系和其对照统称为FGKO组,摘除丝腺、假手术和正常统称为SGE组。首先进行了生物学统计,结果表明FGKO的蛹重增加了19.08%,茧层率降低了67.2%。SGE的蛹重增加了32.49%。之后的PLS-DA分析表明,FGKO组或SGE组血淋巴代谢特征发现处理组与其对照的分离趋势都非常明显,这说明敲除Bmfib-H基因或摘除丝腺后血淋巴的代谢特征发生了显著变化。在此基础上,开展了差异代谢物的筛选,结果发现FGKO组中有60个结构被鉴定的差异代谢物,其中仅有5个代谢物在敲除Bmfib-H基因后含量升高。SGE组摘除丝腺和假手术之间存在66个结构被鉴定的差异代谢物,其中只有9个差异物代谢物在摘除丝腺后含量升高。FGKO组和SGE